凝溶胶蛋白结合剂组合物及其用途制造技术

一般而言，本发明专利技术涉及能结合凝溶胶蛋白多肽的凝溶胶蛋白结合剂(例如抗体)。本发明专利技术的凝溶胶蛋白结合剂可单独或组合用于检测测试样品中的凝溶胶蛋白多肽(也称为靶多肽)以及用于纯化天然凝溶胶蛋白蛋白质。凝溶胶蛋白结合剂还可用于在有所需要的受试者中诊断凝溶胶蛋白相关医学状况。本发明专利技术提供了用于检测生物学样品中的凝溶胶蛋白的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
一般而言，本专利技术涉及凝溶胶蛋白结合剂的制备及其用途。具体地，本专利技术涉及识 别人血浆凝溶胶蛋白的抗原决定簇(即表位)的抗凝溶胶蛋白抗体的制备及其用于检测凝 溶胶蛋白的用途。
技术介绍
提供以下描述来帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不被承认是 本专利技术的现有技术。肌动蛋白是动物细胞中最丰富的蛋白质，并且构成许多有核细胞蛋白质的 10-20%和肌肉细胞蛋白质的30%。肌动蛋白分子每个结合一个ATP分子，并自身装配成长 丝，这期间ATP被水解成ADP。损伤动物组织导致肌动蛋白释放入细胞外间隙(包括血流)中。虽然约一半的非 肌肉细胞肌动蛋白是F-肌动蛋白(自G-肌动蛋白单体装配的双螺旋的、杆状的、细丝形 式的肌动蛋白)，但是细胞外液的离子条件有利于肌动蛋白聚合，因此预期实际上所有从濒 死细胞释放入血液中的肌动蛋白会聚合成细丝(Lind，S. Ε.等，Am. Rev. Respir. Dis. 138 429-434 (1988))。在纯化的溶液中，在没有细丝缩短蛋白的情况中，肌动蛋白丝能容易地达 到数微米的长度。然而，假如自受伤细胞释放的肌动蛋白的一些部分被不可逆变性，要不然 被结合至下文所讨论的胞内肌动蛋白结合蛋白之一，那么此肌动蛋白会保持单体。有许多与肌动蛋白天然结合的蛋白质(关于肌动蛋白结合蛋白的综述，参见 Stossel 等，Ann. Rev. Cell Biol. 1 :353-402 (1985) ；Pollard 等，Ann. Rev. Biochem. 55 987-1035(1986))。然而，认为两种蛋白质，即凝溶胶蛋白和DBP (维生素D结合蛋白)主要 负责结合胞外肌动蛋白(Janmey等，Blood70 :5^-530(1987))。凝溶胶蛋白是一种肌动蛋 白结合蛋白，其是肌动蛋白丝装配和解装配的关键调节物。凝溶胶蛋白是具有6个同源亚 域(称为S1-S6)的82-kDa蛋白质。每个亚域包含一个五链β片层，侧翼有两个α -螺旋， 一个相对于这些链垂直定位，而另一个平行定位。N端(Sl-S;3)形成延伸的β片层，C端 (S4-S6)亦然(Kiselar等，PNAS 100 =3942-3947 (2003)) 该蛋白质在物种间高度保守且 高度同源。凝溶胶蛋白位于细胞内(在胞质溶胶和线粒体中)和细胞外(在血浆中)(Koya 等，J Biol Chem 275(20) 15343-15349 (2000)) 凝溶胶蛋白在调节肌动蛋白聚合方面具有数项功能。首先，凝溶胶蛋白牵涉单体 肌动蛋白结合。在存在Ca2+的情况中，凝溶胶蛋白结合两个肌动蛋白单体。凝溶胶蛋白还 能通过另一个肌动蛋白结合位点结合肌动蛋白丝。其次，凝溶胶蛋白结合两个肌动蛋白单 体以为肌动蛋白聚合形成核，并为肌动蛋白丝带刺的(barbed)末端加帽。如此，凝溶胶蛋 白能够充当肌动蛋白聚合的核，并为初生微丝的末端加帽。最后，凝溶胶蛋白具有肌动蛋白 切割活性。由于细胞中的大量肌动蛋白，从濒死细胞释放肌动蛋白提供足够肌动蛋白而对 微环境具有显著影响，其通过提高血浆的细胞外液粘度和/或通过俘获细胞或通过其它 至今尚未鉴定的毒性效应来实现。细胞外游离的肌动蛋白的输注对动物组织，尤其是对肾和心肺系统是有毒的(Harper 等，Clin. Res. 36 :625A(1988) ；Haddad 等，PNAS 87 1381-1385(1990))。急性肾衰竭是肌肉损伤的并发症，并且大鼠中的肌动蛋白输注引起血 液尿素氮(BUN)和肌酸酐水平的瞬时升高，这与肾衰竭一致。血浆中的游离肌动蛋白可 以形成细丝，其可以导致多器官功能障碍综合征(Dahl等，Shock 12(2) :102-4(1999))。 此外，因为细丝中的每个胞外肌动蛋白分子具有与其结合的ADP分子，所以血液中胞外 肌动蛋白的存在可趋向于以对宿主可能没有益处的方式诱导或提升血小板聚集(Lind 等，Am. Rev. Respir. Dis. 138 :429-434(1988) ；Scarborough 等，Biochem. Biophy. Res. Commun. 100 1314-1319 (1981))。因此，血浆凝溶胶蛋白具有清除自死亡和濒死细胞释放的 肌动蛋白的生死攸关的功能，而且血浆凝溶胶蛋白水平表现为经历外伤的患者中的早期预 后标志物(Mounzer 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160 :1673-81 (1999))。专利技术概述一般而言，本专利技术涉及凝溶胶蛋白结合剂的制备及其用途。具体地，本专利技术涉及识 别人血浆凝溶胶蛋白的抗原决定簇(即表位)的抗凝溶胶蛋白抗体的制备及其用于检测凝 溶胶蛋白的用途。一方面，本专利技术提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与由选自下组的保 藏细胞系所生成的抗体具有相同的抗原结合特异性CGMCC编号2114、2115、和2116。在 一个实施方案中，本专利技术提供了一种抗体或其抗原结合片段，其至少包含选自下组的重链 ⑶R3氨基酸序列或其具有一处或多处保守氨基酸替代的变体FAQGALKSED(SEQ ID NO. 2) ,SEPDGFffEAL(SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)，其中所述抗体或其片段特 异性结合凝溶胶蛋白。在一个实施方案中，本专利技术提供了编码本专利技术的抗体或抗原结合片 段的核酸组合物。在一个实施方案中，本专利技术提供了 一种载体，其包含编码本专利技术的抗体或 抗原结合片段的核酸组合物。所述载体可以进一步包含与所述核酸分子可操作连接的启动 子。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种宿主细胞，其包含包含编码本专利技术的抗体或抗原 结合片段的核酸组合物的载体。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种连续细胞系，其生成 单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗体结合相同的 抗原决定簇=CGMCC编号2114、2115、和2116，其中所述细胞系是通过融合如下的淋巴细胞 与小鼠骨髓瘤细胞的过程生成的，所述淋巴细胞是自用癌瘤细胞或其免疫原性决定簇免疫 的小鼠衍生的。另一方面，本专利技术提供了一种用于制备免疫特异性结合多肽SEQ IDN0. :1的抗体 或其片段的方法，该方法包括下列步骤(a)在提供所述抗体或其片段表达的条件下培养 含有依照权利要求4的核酸的细胞；并(b)回收所表达的抗体或其片段。另一方面，本专利技术提供了一种分离的凝溶胶蛋白表位，其包含选自下组的氨基酸 序列FAQGALKSED (SEQ ID N0. 2), SEPDGFffEAL (SEQ IDN0. 3)、禾口 ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)，其中所述表位受到能够结合全长人凝溶胶蛋白的抗体识别。在一个实施方案中， 本专利技术提供了一种抗体或其抗原结合片段，其是通过制备含有包含选自下组的氨基酸序列 的凝溶胶蛋白表位的免疫原而生成的FAQGALKSED (SEQ ID NO. 2), SEPDGFffEAL (SEQ ID NO. :3)、和 ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)。一方面，本专利技术提供了一种用于测定生物学样品中凝溶胶蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种抗体或其抗原结合片段，其与由选自下组的保藏细胞系所生成的抗体具有相同的抗原结合特异性：ＣＧＭＣＣ编号２１１４、２１１５、和２１１６。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其抗原结合片段，其与由选自下组的保藏细胞系所生成的抗体具有相同 的抗原结合特异性CGMCC编号2114、2115、和2116。2.一种抗体或其抗原结合片段，其至少包含选自下组的重链CDR3氨基酸序列或其具 有一处或多处保守氨基酸替代的变体FAQGALKSED(SEQID NO. 2), SEPDGFffEAL(SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV(SEQ IDNO. :4)，其中所述抗体或其片段特异性结合凝溶胶蛋白。3.—种连续细胞系，其生成单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与由选自下组的杂交瘤 细胞系所生成的抗体结合相同的抗原决定簇CGMCC编号2114、2115、和2116，其中所述细 胞系是通过融合如下的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的过程生成的，所述淋巴细胞是自用癌 瘤细胞或其免疫原性决定簇免疫的小鼠衍生的。4.一种分离的核酸，其编码权利要求1-2任一项的抗体或其抗原结合片段。5.一种载体，其包含权利要求4的核酸。6.权利要求5的载体，其进一步包含与所述核酸分子可操作连接的启动子。7.一种宿主细胞，其包含权利要求5的载体。8.一种用于制备免疫特异性结合多肽SEQ ID NO. :1的抗体或其片段的方法，该方法 包括(a)在提供所述抗体或其片段表达的条件下培养含有依照权利要求4的核酸的细胞；并(b)回收所表达的抗体或其片段。9.一种分离的凝溶胶蛋白表位，其包含选自下组的氨基酸序列FAQGALKSED(SEQ ID NO. 2) ,SEPDGFffEAL (SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV(SEQ ID NO. :4)，其中所述表位受到能 够结合全长人凝溶胶蛋白的抗体识别。10.一种抗体或其抗原结合片段，其是通过制备含有权利要求9所述的表位的免疫原 而生成的。11.一种用于测定生物学样品中凝溶胶蛋白的存在或量的方法，包括(a)使生物学样品与一种或多种如下的抗体或其抗原结合片段在所述抗体或其片段特 异性结合凝溶胶蛋白的条件下接触，所述抗体或其抗原结合片段具有由选自下组的保藏细 胞系所产生的相同抗原结合特异性=CGMCC编号2114、2115、和2116 ；并(b)检测结合至凝溶胶蛋白的抗体或其片段的存在或量，由此测定所述样品中凝溶胶 蛋白的存在或量。12.权利要求11的方法，其中在ELISA中使所述样品与所述抗体或抗原结合片段接触。13.权利要求12的方法，其中所述接触步骤包括将第一抗体结合至基片，接触所述样 品，并将第二抗体结合至所述基片，其中所述第二抗体包含可检测标记物。14.权利要求13的方法，其中所述第一抗体与由杂交瘤细胞系CGMCC编号2115所生成 的抗体结合相同的抗原决定簇，而所述第二抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗 体结合相同的抗原决定簇CGMCC编号2114和2116。15.一种用于在第一哺乳动物受试者中测定与凝溶胶蛋白多肽水平改变有关的疾病或 状况的存在或素因的方法，该方法包括下列步骤(a)提供来自第一哺乳动物受试者的测试样品；(b)使所述来自第一哺乳动物受试者的测试样品与一种或多种结合凝溶胶蛋白多肽的化合物接触以形成化合物/凝溶胶蛋白多肽复合物，其中所述化合物是具有由选自下组的 杂交瘤细胞系所产生的相同抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段CGMCC编号2114、 2115、和 2116 ；(c)检测化合物/凝溶胶蛋白多肽复合物的水平；(d)量化所述来自第一哺乳动物受试者的样品中的凝溶胶蛋白多肽表达水平；并...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈恩允，余征，周敏，郭菲，
申请(专利权)人：北京同为时代生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11