基于重组ＵＬ５１蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法技术

本发明专利技术涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测并判定等步骤，本方法是基于纯化的重组ＵＬ５１蛋白建立的间接ＥＬＩＳＡ法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒（ＤＨＶ）、鸭疫里默氏菌（ＲＡ）、鸭大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法的批内或批间重复试验显示变异系数均小于１０％，能检出经１∶３２００倍稀释的ＤＰＶ疫苗免疫鸭阳性血清。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物医学领域，特别涉及基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法。
技术介绍
鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段；但是，由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大规模应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗体检测方法，该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤，且操作简单，特异性、灵敏性较高。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，具体步骤为：a固相抗原的制备：将包被浓度大于或等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b一抗结合：将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c二抗结合：将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测及结果判定：将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD450nm值，当OD450nm值＞0.216时判为阳性，当OD450nm≤0.216时判为阴性。进一步，所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于，具体步骤为：a固相抗原的制备：将包被浓度等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载-->体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b一抗结合：将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c二抗结合：将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD450nm值，所述OD450nm值＞0.216为阳性，所述OD450nm≤0.216则为阴性；进一步，步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL；进一步，步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP；进一步，步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为1％的牛血清白蛋白溶液；进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；进一步，步骤d中避光显色的时间为20分钟；进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)和鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶3200倍稀释的DPV阳性血清。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III；1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为阴性对照(未加IPTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-7的IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图2-C为不同温度诱导pET28a-UL51表达结果：1-3的温度分别为20、30和37℃；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果：1-8的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。-->图3为重组UL51蛋白的检测：(a)SDS-PAGE分析：M为蛋白标准(KD)；1为发酵培养的全菌液；2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白；3为透析复性后的重组UL51蛋白；(b)Western blotting分析：1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白(约为34KD)。图4为敏感性试验检测结果。图5为特异性试验结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本实施例首先对所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；同时，用Westernblotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定了重组UL51蛋白的包被浓度及一抗、二抗的稀释度，从而制备了鸭瘟病毒抗体检测方法。实施例基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化1、材料方法以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1.1菌株、质粒和毒株质粒pMD18-T，购自大本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于重组ＵＬ５１蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于，具体步骤为：ａ固相抗原的制备：将包被浓度大于或等于２．５μｇ／１００μＬ的重组ＵＬ５１蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；ｂ一抗结合：将待检血清作体积小于或等于２００倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与步骤ａ所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；ｃ二抗结合：将酶标二抗作体积小于或等于２０００倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与步骤ｂ所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原－抗体－二抗复合物；ｄ显色：在步骤ｃ所得抗原－抗体－二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；ｅ检测及结果判定：将步骤ｄ所得显色样品液用酶标仪测定ＯＤ↓［４５０ｎｍ］值，当ＯＤ↓［４５０ｎｍ］值＞０．２１６时判为阳性，当ＯＤ↓［４５０ｎｍ］≤０．２１６时判为阴性。

【技术特征摘要】
1.基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于，具体步骤为：a固相抗原的制备：将包被浓度大于或等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b一抗结合：将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c二抗结合：将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；e检测及结果判定：将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD450nm值，当OD450nm值＞0.216时判为阳性，当OD450nm≤0.216时判为阴性。2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗的体检测方法，其特征在于，具体步骤为：a固相抗原的制备：将包被浓度等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b一抗结合：将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c二抗结合：将酶标...

【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，汪铭书，沈婵娟，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学实验动物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]