稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法技术

本发明专利技术属生物医学领域，旨在提供稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法。本发明专利技术通过构建含有ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬报告基因的慢病毒表达载体，并使用该表达载体感染具有高转移潜能的肝癌细胞，使宿主细胞稳定高效表达ＥＧＦＰ－ＬＣ３，稳定指示细胞自噬变化。应用该细胞株可以于体外和体内建立转移研究模型，观察自噬在转移中的改变，并采用基于Ｔｏｐ－ｈａｔ算子和形态滤波的图像分析方法快速定量分析细胞自噬改变。本发明专利技术具有自噬指示稳定可靠、实时灵敏、转移发生确切，自噬定量快速准确、操作简便等特点，可极大地方便自噬与转移的相关研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及一种能够稳定指示细胞自噬活动同时又具备高转 移潜能的肝癌细胞株，以及该细胞株的建立和应用方法。
技术介绍
原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的 第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55%。 全国第三次死因回顾抽样调查报告显示肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在 城市和男性则是首位死因)。如何有效防治肝癌是我国目前亟需解决的重大问题。在影响肝癌患者生存的诸多因素中，转移复发是最为主要的因素。肝癌患者在就 诊时，多数已发生转移而无法手术治疗，可手术治疗率只有15-30%。即使手术，患者术后5 年的总体转移复发率也高达50-80% (多数于2年内复发)。因此，肝癌转移复发的防治是 治疗肝癌的关键，相关的研究紧要而迫切。自噬被认为可能在肝癌转移中起重要作用。自噬是一种细胞自我降解消化的过 程，在细胞处于不利于细胞生存的应激条件时，细胞通过循环利用细胞内成份，维持营养和 生物能量的稳定，清除受损或多余的蛋白质和细胞器，维持细胞自我稳态，维持细胞生存。 其在肿瘤细胞克服不良应激(如缺血缺氧代谢应激、放化疗等细胞毒作用等)，维持癌细胞 生存，进而促进肿瘤发生发展的重要作用已为近年来的研究证实。由于自噬在维持肿瘤细 胞生存中的重要作用，而肝癌细胞转移又是一个不断克服不良环境作用的复杂过程，自噬 一直被推测可能在肝癌细胞转移过程中起重要作用。然而，这种推论一直未能得到很好的研究和证实，究其原因，主要是因为缺乏良好 的研究工具和模型。要满足自噬与肝癌细胞转移的相关研究，需要有良好的研究用的肝癌 细胞株。这个肝癌细胞株需要满足如下条件具备高转移能力，能够在体内和体外很好地模 拟癌转移过程；具备良好的自噬指示能力，能够实时显示自噬的改变并便于联合其他相关 技术观察分析。目前的肝癌细胞株尚不能满足研究所需。这主要是因为(1)通用肝癌细胞株不 具备高转移能力目前广泛使用的肝癌研究工具细胞，如ATCC的HepG2等，不具备高转移 能力，难以在体内和体外良好地复制转移过程(特别是体内转移)；( 自噬指示观察及快 速定量分析方法不足目前自噬研究采用的自噬观察方法有很大的局限性，无法完成转移 过程中自噬变化等观察。目前广泛用于观察自噬的方法主要包括透射电镜、吖啶橙染色荧 光显微镜或流式细胞术，Western blot检测等。这些观察方法是通过对某个时间点的细胞 进行断点取材观察，对于实时动态观察存在不足，而转移是一个不断变化的动态的过程， 因此很多过程无法观测到。例如在侵袭移动过程中，癌细胞侵透胞外细胞基底膜运动的 过程，即使在体外应用Matrigel模拟，这一运动过程中自噬的动态改变通过以上方法也很 难观察；而癌细胞在进出循环系统以及在循环系统内播散时自噬的改变，定植扩增并形成转移灶时的改变，更难以观察。此外，这些方法还存在其它不足，如透射电镜法样本制作 过程繁琐，观察不便，难以定量或半定量分析；吖啶橙染色法特异性差，易于出现假阳性或 假阴性结果，可靠性差；Western blot法检测步骤多、时程长，工作量大，检测费用高等。使 用GFP绿色荧光蛋白标记LC3形成GFP-LC3自噬报告基因标记细胞使细胞指示自噬，借助 荧光显微镜观察自噬活动，是近年来出现的一种新的自噬观察方法，这种方法使得实时动 态观察自噬改变成为可能。该方法利用自噬发生过程中自噬关键分子LC3由LC3-I变为 LC3-II，LC3在细胞内的分布发生改变(由LC3-I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3-II的富 集于自噬体上)，以GFP标记LC3分子，通过荧光分布的改变(由GFP-LC3-I弥散分布于细 胞质之弥散绿色荧光变为GFP-LC3-II富集于自噬体上形成绿色荧光亮点)及变化程度来 观察分析自噬的发生和发生强度。理论上，该方法具有实时动态观察、简便快捷等诸多优 势，但在实际工作中却不易实现。其主要问题在于缺乏能够高效稳定地将GFP-LC3基因导 入细胞并使之稳定表达的方法。目前广泛应用的建立表达GFP-LC3基因的方法是通过脂质 体转染方法(瞬时转染)将携带GFP-LC3基因的重组表达质粒转入细胞内并使其在细胞内 表达。GFP-LC3瞬时转染法建立的GFP-LC3表达不稳定，导致自噬指示不稳定，细胞在连续 传代后自噬指示减弱或丧失，而转移过程是一个时间跨度较大的过程，这使得其难以满足 转移过程的自噬观察(特别是在体内转移模型观察时)。例如模式生物是高可信的研究 方法，应用小鼠或斑马鱼于体内建立转移模型进行研究是获得最接近人体试验结果的可靠 方法。而应用人肝癌细胞建立该模型，需要细胞能够稳定指示自噬，以目前通用的瞬时转染 技术产生的自噬指示细胞，于体内种瘤，在细胞分裂多次瘤生长至一定大小后(远在癌细 胞转移发生之前)，GFP-LC3自噬指示即减弱或丧失，这使得体内观察转移过程中自噬的改 变无法实现。传统的GFP-LC3研究方法除存在上述稳定表达方面的不足外，还存在应用方 法方面的严重不足缺乏快速可靠的自噬定量分析方法。传统的自噬定量方法为人工肉眼 计数GFP-LC3自噬荧光亮点，再人工计数细胞，计算获得平均荧光亮点数/细胞。人工计数 工作量很大(每一个处理组总计数细胞量通常在200以上，总荧光亮点计数量通常在1000 以上)，尤其是在多因素、大样本量实验时工作非常繁重，计数者易于视疲劳计数出错，可靠 性较差，同时人工计数主观随意性大，定量分析结果因缺乏足够客观性而可信度有限等。此 外，传统的GFP-LC3方法还存在其他一些不足，包括转染效率低下、转染试剂具有细胞毒性 和自噬诱导作用等。其中转染试剂的自噬诱导作用对于自噬的相关研究有较大影响，因为 转染试剂可诱导自噬，并在转染试剂去除后仍维持较长时间，造成本底背景自噬很高，在背 景自噬高的情况下，将难以准确判断自噬的发生及改变。总之，目前的肝癌细胞株及相关研究方法不能满足自噬与转移的研究所需，迫切 需要能够克服当前不足的肝癌细胞株及其相关应用方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能够稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立方法 和应用方法。本专利技术提供的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，已于2010年09月沈日保 藏于“中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心)”，其保藏号为 “CCTCCC201097”和“CCTCC C2010102”，分类命名为“稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H-GFP-LC3”和“稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3-GFP-LC3”。本专利技术的技术方案如下本专利技术以本所(复旦大学肝癌研究所)前期建立的高转移潜能肝癌细胞MHCC97H 和HCCLM3为母细胞，利用慢病毒表达载体技术将EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组， 使之稳定表达EGFP-LC3，实现稳定自噬指示，建立满足研究所需的稳定指示自噬的高转 移肝癌细胞株；再进一步地通过结合应用基于Top-hat算子的图像分析技术实现自噬指 示的快速定量分析，建立所述细胞株的相关应用方法。本专利技术应用的母细胞是申请人所 在的复旦大学肝癌研究所已经建立的高转移潜能肝癌细胞MHCC97H (本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，其特征是：①稳定指示细胞自噬：细胞稳定表达ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬报告基因，可在激发波长为４８８ｎｍ、发射波长为５０９ｎｍ的条件下用荧光显微镜进行观察，通过ＥＧＦＰ－ＬＣ３的胞内荧光分布改变指示细胞自噬活动，荧光稳定不淬灭；ＥＧＦＰ－ＬＣ３基因整合入宿主细胞基因组，传代不丢失，表达稳定，其荧光强度不随细胞传代而减弱；②细胞具备高转移潜能：细胞在裸鼠皮下成瘤６－８周或肝脏原位种植５－６周后可自发形成肺转移。

【技术特征摘要】
1.稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，其特征是①稳定指示细胞自噬细胞稳 定表达EGFP-LC3自噬报告基因，可在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下用荧 光显微镜进行观察，通过EGFP-LC3的胞内荧光分布改变指示细胞自噬活动，荧光稳定不淬 灭；EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组，传代不丢失，表达稳定，其荧光强度不随细胞传 代而减弱；②细胞具备高转移潜能细胞在裸鼠皮下成瘤6-8周或肝脏原位种植5-6周后 可自发形成肺转移。2.一种建立权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的方法，其特征 是建立所述细胞株的步骤如下①构建EGFP-LC3慢病毒表达载体人工合成人LC3基因，插入pUC57载体，构建成 PUC57-LC3 ；用Nhe I和Age I对pUC57_LC3进行双酶切，获得384bp的LC3基因片段；用 Nhe I和Age I对pLV_UbC-EGFP_3FLAG表达质粒进行酶切，将LC3基因连接入表达质粒，构 建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；将表达质粒pLV-UbC_EGFP_LC3和包装质粒pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G混合，于细胞包装形成EGFP-LC3慢病毒；纯化，浓缩、测定滴度；② 以EGFP-LC3慢病毒感染高转移潜能肝癌细胞取对数生长期细胞，30%融合，以MOI = 40 计算所需病毒量，病毒与polybrene混勻于培养液后作用对象细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊嘉，史颖弘，彭远飞，丁振斌，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]