糖聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子制造技术

本发明专利技术提供了粒细胞刺激集落因子和ＰＥＧ部分之间的缀合物。通过插入肽和修饰基团之间并共价连接这两者的完整糖基连接基团来连接该缀合物。通过糖基转移酶的作用从糖基化和非糖基化的肽形成缀合物。糖基转移酶将修饰糖部分连接至肽上的氨基酸或糖基上。还提供了包括缀合物的药物制剂。制备缀合物的方法也在本发明专利技术的范围之内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子的制作方法相关申请的交叉参考本申请享有2003年12月3日申请的U.S.临时专利申请No.60/526,796；2004年3月23日申请的U.S.临时专利申请No.60/555,813；2004年5月11日申请的U.S.临时专利申请No.60/570,282；2004年1月26日申请的U.S.临时专利申请No.60/539,387；2004年7月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/592,744；2004年9月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/614,518；和2004年10月29日申请的U.S.临时专利申请No.60/623,387的优先权，其中每个在此以其整体引入作为参考，用于所有目的。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞祖细胞和成熟嗜中性粒细胞存活、增殖、分化和功能的糖蛋白。临床用途中两种形式的重组人G-CSF是嗜中性粒细胞生成的有效的刺激剂并已经证明在一些嗜中性白细胞减少症中的防止感染并发症的有效性。它们可以用于促进骨髓抑制治疗的嗜中性白细胞恢复。G-CSF通过降低发热性嗜中性白细胞减少症的发生降低了癌症化疗的发病率，降低了通过骨髓移植支持的高剂量化疗的发病率，和降低了严重慢性嗜中性白细胞减少症患者感染的发生和持续。此外，最近已经表明当心肌梗死发作后给药时，G-CSF具有治疗效果。日本和美国小组在1986年克隆了人形式的G-CSF(参见，例如，Nagata等，Nature 319415-418，1986)。天然人糖蛋白存在两种形式，一种为175个氨基酸，另一种为178个氨基酸。更丰富和更有活性的175个氨基酸形式已经通过重组DNA技术用于药品开发中。在大肠杆菌(E.coli)表达系统中合成的重组人G-CSF称为非尔司啶(filgrastim)。非尔司啶的结构略不同于天然糖蛋白。另一种形式的重组人G-CSF称为利诺司啶(lenograstim)并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中合成。hG-CSF是单体蛋白，通过2个G-CSF分子和2个受体的2∶2复合物的形成使G-CSF受体二聚(Horan等，Biochemistry，35(15)4886-96(1996))。通过X-射线晶体图象研究已经鉴定以下的hG-CSF残基作为受体结合界面的一部分G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123和L124(参见，例如，Aritomi等，(1999)Nature 401713)。可购得形式的rhG-CSF具有短期药物效果且对于白细胞减少症的持续必须一天多于一次的经常给药。具有较长循环半衰期的分子将减少缓解白细胞减少症并防止随后感染的必要给药次数。目前可获得rG-CSF产品的另一个问题是剂量依赖性骨痛的发生。由于骨痛是作为rG-CSF治疗的显著副作用而患者所经历的，理想的是提供没有导致骨痛的rG-CSF产品，通过本质上不具有该作用的产品或足够小剂量的该产品是有效的而没有引起骨痛。因此，明确地需要改进的重组G-CSF分子。已经报道了hG-CSF的蛋白工程化变体(U.S.专利No.5,581,476，U.S.5,214,132，U.S.5,362,853，U.S.4,904,584和Riedhaar-Olson等，Biochemistry 359034-9041，1996)。还报道了hG-CSF和其他多肽的修饰，使得与天然多肽相比较引入了至少一个另外的碳水化合物链(U.S.专利No.5,218,092)。此外，已经报道和研究了天然hG-CSF的聚合物修饰，包括连接PEG基团(参见，例如，Satake-Ishikawa等，(1992)Cell Structure and Function 17157；Bowen等(1999)Experimental Hematology 27425；U.S.专利No.5,824,778，U.S.5,824,784，WO96/11953，WO95/21629和WO94/20069)。在提高糖蛋白治疗剂药物动力学性能的尝试中将合成聚合物连接肽主链是本领域已知的。已经与肽缀合的示范性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。已经证明使用PEG来衍生肽治疗剂能降低肽的免疫原性。例如，U.S.专利No.4,179,337(Davis等)公开了结合聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的非免疫原性多肽如酶和肽激素。除了降低的免疫原性，由于所述多肽的PEG缀合增加的大小，延长了循环中的清除时间。PEG及其衍生物连接肽的主要模式是通过肽氨基酸残基的非特异性结合(参见，例如，U.S.专利No.4,088,538，U.S.专利No.4,496,689，U.S.专利No.4,414,147，U.S.专利No.4,055,635和PCT WO87/00056)。连接PEG和肽的另一种模式是通过糖肽上糖基的非特异性氧化(参见，例如，WO94/05332)。这些非特异性方法中，以随机、非特异性的方式将聚(乙二醇)添加至肽主链上的反应性残基。当然，PEG分子的随机加入具有其缺陷，包括缺乏成品的均一性，和降低肽的生物或酶活性的可能性。因此，对于治疗肽的生产，形成特异性标记的、容易表征的、实质上均一产品的衍生策略是优选的。已经产生了这样的方法。通过酶的作用可以在体外生产特异性标记的、均一的肽治疗剂。与连接合成聚合物或其他标记和肽的典型非特异性方法不同，基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优势。标记肽合成中所用的两个主要类别的酶是糖基转移酶(例如，唾液酸转换酶、寡糖转移酶、N-乙酰基氨基葡糖基转移酶)和糖苷酶。这些酶可以用于糖的特定连接，随后可以修饰这些糖来包括治疗剂部分。或者，糖基转移酶和修饰的糖苷酶可以用于将修饰的糖直接转移至肽主链(参见，例如，U.S.专利6,399,336和U.S.专利申请公开20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，其中每个在此引入作为参考)。结合化学和酶合成要素的方法也是已知的(参见，例如，Yamamoto等，Carbohydr.Res.305415-422(1998)和U.S.专利申请公开20040137557，其在此引入作为参考)。响应改进治疗G-CSF的需要，本专利技术提供了糖聚乙二醇化(glycopegylated)的G-CSF，是治疗上活性的且相对于相同的或接近的类似物、非糖聚乙二醇化的G-CSF肽具有提高的药物动力学参数和性能。此外，本专利技术提供了成本有效和工业规模生产本专利技术改进G-CSF肽的方法。专利技术概述现在已经发现用一个或多个聚(乙二醇)部分受控修饰粒细胞集落刺激因子(G-CSF)获得了新的G-CSF衍生物，该衍生物与相应的天然(未-聚乙二醇化)的G-CSF相比较具有提高的药物动力学特征(图3)。此外，糖聚乙二醇化的G-CSF的药物活性与可购得的单-聚乙二醇化非尔司啶的大约相同(图4)。示范性实施方案中，通过酶介导的在糖基化或非糖基化G-CSF肽和酶可转移糖基部分之间形成缀合物来生产本专利技术的“糖聚乙二醇化”的G-本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括以下部分的粒细胞集落刺激因子肽：　　　　＊＊＊　　　　其中　　　　Ｄ选自－ＯＨ和Ｒ↑［１］－Ｌ－ＨＮ－；　　　　Ｇ选自Ｒ↑［１］－Ｌ－和－Ｃ（Ｏ）（Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］）烷基；　　　　Ｒ↑［１］是包括选自含有直链或支链聚（乙二醇）残基部分的成员的部分；和　　　　Ｌ是连接物，其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基，　　　　使得Ｄ是ＯＨ时，Ｇ是Ｒ↑［１］－Ｌ－，且当Ｇ是－Ｃ（Ｏ）（Ｃ↓［１］－Ｃ↓［６］）烷基时，Ｄ是Ｒ↑［１］－Ｌ－ＮＨ－。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-12-3 60/526,796;US 2004-1-26 60/539,387;US1.包括以下部分的粒细胞集落刺激因子肽 其中D选自-OH和R1-L-HN-；G选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基；R1是包括选自含有直链或支链聚(乙二醇)残基部分的成员的部分；和L是连接物，其选自键、取代或未取代的烷基和取代或未取代的杂烷基，使得D是OH时，G是R1-L-，且当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。2.根据权利要求1的肽，其中L-R1具有通式 其中a是0至20的整数。3.根据权利要求1的肽，其中R1具有选自以下的结构 其中e和f是独立地选自1至2500的整数；和q是0至20的整数。4.根据权利要求1的肽，其中R1具有选自以下的结构 其中e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和q和q′是独立地选自1至20的整数。5.根据权利要求1的肽，其中R1具有选自以下的结构 其中e、f和f′是独立地选自1至2500的整数；和q、q′和q″是独立地选自1至20的整数。6.根据权利要求1的肽，其中R1具有选自以下的结构 其中e和f是独立地选自1至2500的整数。7.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述部分具有通式8.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述部分具有通式9.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述部分具有通式 其中AA是所述肽的氨基酸残基。10.根据权利要求9的G-CSF肽，其中所述氨基酸残基选自丝氨酸或苏氨酸。11.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。12.根据权利要求11的G-CSF肽，其中所述氨基酸残基是SEQ.ID.NO1位置133的苏氨酸。13.根据权利要求1的肽，其中所述肽具有选自SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2的氨基酸序列。14.根据权利要求1的G-CSF肽，其中所述部分具有通式 其中a、b、c、d、i、r、s、t和u是独立地选自0和1的整数；q是1；e、f、g和h是独立地选自0至6的整数；j、k、l和m是独立地选自0和100的整数；v、w、x和y独立地选自0和1，且v、w、x和y中至少一个是1；AA是所述G-CSF肽的氨基酸残基；Sia-(R)具有通式 其中D选自-OH和R1-L-HN-；G选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基；R1是包含含有选自直链或支链聚(乙二醇)...

【专利技术属性】
技术研发人员：S德弗里斯，H克劳森，DA佐夫，ZG王，M施瓦茨，武兵元，C鲍，
申请(专利权)人：尼奥斯技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]