本发明专利技术公开一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，工艺可控性好，不易污染，适于工业化、规模化生产；培养空间利用率提高３倍以上，使细胞生长密度达到４．０～５．０×１０↑［６］个／ｍｌ，保证了病毒的增殖空间，同时还通过无菌冲洗、离心处理等方法有效解决了细胞工厂消化后的细胞残留问题，从而可以连续使用细胞工厂进行细胞培养，提高了细胞工厂的重复使用率。
【技术实现步骤摘要】
一种利用细胞工厂制备冻千甲型肝炎减毒活疫苗的方法
-本专利技术涉及一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗制备方法，尤其是公开了一种利用细胞 工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，属于生物制药
技术介绍
传统的病毒性疫苗制备，关键是为病毒提供适宜其增殖的细胞基质，通常采用贴 壁培养的生长方式。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。 转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过度方式，或作为生物反应器接种细胞的 准备途径。其特点是结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、容易扩大等等，同时 也存在着细胞生长密度低、单瓶细胞有生长差异、劳动强度大，占地空间大的等缺点。 是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式。反应器贴壁培养通常采用片状载 体和篮式搅拌系统，可以提供较高的细胞密度， 一般适于多次收获培养产物，国内一 些科研人员曾尝试釆用反应器培养细胞来制备甲肝疫苗，效果均不理想。其原因在于 肝炎病毒在细胞内增殖周期较长，且只能收获一次。本专利技术涉及的"细胞工厂"是丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES和美国 CORNING公司出品的Cell STACK,英文直译分别为细胞工厂或细胞培养室，其培养 原理基本相同，外观尺寸略有差异。使用过程中的关键问题是l.解决了 2BS细胞在 细胞工厂中的生长适应性；2.确定了使用细胞工厂培养L-A-1减毒株的增值高峰期；3. 确定了科学的洗换方法，提高了细胞收获率和细胞工厂连续使用率。
技术实现思路
本专利技术公开，适用于工业 化生产。本专利技术的技术解决方案如下在无菌条件下，采用单层感染法或同时感染法在细胞工厂中将甲型肝炎减毒株(L-A-l)感染2BS细胞后，分别进行35天或28天左右的连续培养，期间需进行2-3 次更换维持液，最终得到甲型肝炎病毒收获液；再经离心收集细胞沉淀、氯仿抽提、 稀释合并后，成为甲型肝炎疫苗原液；原液检定合格后配制成为甲型肝炎疫苗半成品，经分装、冻干、检定合格后，成为冻干甲型肝炎减毒活疫苗。本专利技术的细胞工厂制备的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，每支成品(复溶后体积lml) 含以下组分及含量-甲型肝炎减毒活疫苗 0.755毫升明胶-蔗糖保护剂 0.245毫升复溶后甲型肝炎病毒滴度不低于6.50 lg CCIDWml。本专利技术所述疫苗的具体制备工艺步骤(1) 2BS细胞制备取出冻存的工作细胞库中的细胞管，复苏后混合培养，成单层后，用0.25%胰蛋白 酶消化，于37°C ±0. 5'C静止或旋转培养；(2) 感染2BS细胞。在制备好的细胞中加入毒种稀释液(0.01 0.05MOD，感染细胞，有两种感染方 法单层感染法和悬浮感染法。(3) 更换维持液弃去细胞工厂内液体，加维持液200 250ml/层，置35t:士0.5'C继续培养，7 10 天换液一次，待病毒增殖高峰时收获；(4) 洗换、收获逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，200 300ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消 化液，50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150 200ml/层，振摇至细 胞脱落，无菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲 洗细胞工厂，备下次使用。(5) 离心、抽提于2 8'C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检查， 无菌检査合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀浆，28000rpm/ 分钟，l分钟；细胞匀浆液加入1/3体积的三氯甲烷混合后提纯病毒，3000rpm离心30分钟，连 续抽提病毒液三次；(6) 原液合并、保存、检定同一细胞批生产病毒收获液，经提纯后在无菌条件下合并为一批原液，取样做原液检定。原液放置于-6(TC以下保存3个月； (7)半成品配制及分装将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合均匀后，按 要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥。(8) 冻干将步骤(7)中的分装品冷冻干燥，步骤为-35°。预冻2小时，制品-4(TC冷冻3 4 小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30 35i:恒温真空干燥5 6小时，全过程累计 20 24小时，制备出冻干甲肝减毒活疫苗成品。(9) 成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。 本专利技术通过细胞工厂制备出冻干甲肝减毒活疫苗，在有限的空间内利用了最大限 度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间,并可节省贵重的培养液。更重要的是，它 可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失；特别 适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长 的动力学条件，规格放大变得简单易行，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生 长。本专利技术优点在于工艺可控性好，不易污染，适于工业化、规模化生产；培养空间利用率提高3倍以上，使细胞生长密度达到4.0 5.0Xl()S个/m1,保证了病毒的增殖 空间，同时还通过无菌冲洗、离心处理等方法有效解决了细胞工厂消化后的细胞残留 问题，从而可以连续使用细胞工厂进行细胞培养，提高了细胞工厂的重复使用率。具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本专利技术，而不是以任何方式限制本专利技术。在不背 离本专利技术的精神和原则的前提下，对本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变 都将落入本专利技术的待批权利要求范围之内。实施例1 :选用丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES 10层，36块，采用单层感染法制 备冻干甲肝减毒活疫苗的制备工艺。 1.2BS细胞制备将选好的细胞中用Hank's液清洗细胞表面，再用0.25%胰酶消化细胞，将消化后 的细胞与含10。/。小牛血清的MEM培养液混合，制成细胞悬液，按适宜比例分种(1:5)，无菌加入细胞工厂中，200ml/层，放置37。C士0. 5。C培养7天。2. 单层感染认真检査细胞，确认细胞单层且无污染，弃旧液，用Hank's液轻轻洗细胞面后控 净，加入毒种稀释液(0.03MOI)，置于35。C土0.5。C培养3.5小时，补加维持液(含2% 小牛血清的MEM培养液)至200ml/层，置35。C士0.5。C培养7天后换液。3. 更换维持液弃去细胞工厂内液体，加维持液200ml/层，置35t:士0.5t:继续培养，间隔7天换液 一次，共换液两次，待病毒增殖高峰时收获。4. 洗换、收获逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，250ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150ml/层，振摇至细胞脱落，无 菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲洗细胞工厂， 备下次使用。5. 离心、抽提于2 『C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检査， 无菌检査合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀浆，28000rpm/ 分钟，l分钟；细胞匀浆液加入l/3体积的三氯甲垸混合后提纯病毒，300本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用细胞工厂制备的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于由以下组分组成： 每支成品（复溶后体积１ｍｌ）含以下组分及含量： 甲型肝炎减毒活疫苗： ０．７５５毫升 明胶－蔗糖保护剂： ０．２４５毫升 复溶后甲型肝炎病 毒滴度不低于６．５０ｌｇ ＣＣＩＤ↓［５０］／ｍｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘景晔，谢宝生，周妍，屈翠波，占永生，王云霞，
申请(专利权)人：长春长生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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