本发明专利技术公开了一种聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物，所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式－ＣＨ↓［２］－Ｘ－Ｓ－Ｙ－中的－ＣＨ↓［２］－基团与促红细胞生成素的氨基形成－ＮＨ－ＣＨ↓［２］－键连接而得到。本发明专利技术还公开了上述偶联物的制备方法，即偶联物是由促红细胞生成素和含有已保护巯基的醛类物质发生还原胺化反应，形成通过－ＮＨ－ＣＨ↓［２］－键连接的活化促红细胞生成素；进一步与甲氧基聚乙二醇衍生物偶联而得到，该方法具有反应位点更单一，质量更可控的优点。本发明专利技术提供的聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物或含有聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物的药物组合物可在治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病中广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚乙二醇促红细胞生成素偶联物，该偶联物具有提高体内血红蛋白含量和网织红细胞数目的生物学活性，本专利技术的应用领域涉及生物化学、药物化学以及人类疾病的治疗。
技术介绍
促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水.化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型，a型含34^的碳水化合物，p型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinant hum肌erythropoietin, rHuEPO)，广泛用于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie，JC,Strickland， TW， Lane， J等(986)免疫生物学(lmmunobiol)72:213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人EPO的多肤链的分子量是18236Da.在完整的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40%( J.Biol.Chem.262: 12059)。促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用EPO还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；EPO纠正肾性贫血的疗效几乎100%,但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占了119亿美元，有巨大的市场容量。早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素(EPOGEN)用于肾性贫血的治疗，但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25%，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，EPO己进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了 30%。促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素。对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用EPO(Danna， RP， Rudnick, SA， Abels， RI，于:MB， Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一国际展望(Erythropoietin inClinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker;1990:p301-324)。但是当前可获得未被修饰的促红细胞生成素的血浆半衰期短，容易遭受蛋白酶降解，利用率不高，这些缺陷阻止它们取得最大的临床疗效。因此获得长效的促红细胞生成素已,经成了各大研究机构及制药企业竞相研发的热点，如己经上市的amgen公司的长效促红细胞生成素产品(aransp)是通过基因工程的手段增加糖基化的位点数目，进而提高糖基化的程度，达到每两周注射一次，改善了促红细胞生成素在体内的半衰期，但是这种产品由于仍然无法避免体内蛋白酶的酶解影响，因此延长体内半衰期的程度有限，并且生产成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物学活性更好，生物利用度更高的的聚乙二醇修饰的促红细胞生成素偶联物以及该偶联物的制备方法。本专利技术目的还在于提供一种含有该被修饰的促红细胞生成素偶联物的药物组合物，用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。本专利技术所公开的一种新的聚乙二醇修饰的促红细胞生成素偶联物，其结构通式为P-NH-CH2-X-S-Y- (OCH2CH2) ml-OCH3所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式-(:112《-3-￥"中的-(:112-9基团与促红细胞生成素的氨基形成-NH-CH2-键连接而得到，其中P是指重组人促红细胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-， k的数目选自2 10, ml选自100 2000之间的整数，Y选自<formula>formula see original document page 10</formula>其中m、 n的数目各自独立地选自2 10。其中重组人促红细胞生成素优选重组人促红细胞生成素a或p，特别是a。促红细胞生成素的制备是通过本领域公开的技术而得到。在本方案中，其中m，n优选的整数为2。在本方案中，其中X是-(CH2)k-， k选自2 10。在本方案中，k的数目优选2 4，进一步优选为2。在本方案中，甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量优选为5， 000 40， OOO道尔顿，进一步优选为为20， OOO道尔顿。在本方案中， 一个优选实施方案所对应的偶联物的结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚乙二醇化促红细胞生成素偶联物，其结构通式为 Ｐ－ＮＨ－ＣＨ↓［２］－Ｘ－Ｓ－Ｙ－（ＯＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］）↓［ｍ１］－ＯＣＨ↓［３］ 所述偶联物是由甲氧基聚乙二醇基团通过式－ＣＨ↓［２］－Ｘ－Ｓ－Ｙ－中的－ＣＨ↓［２］ －基团与促红细胞生成素的氨基形成－ＮＨ－ＣＨ↓［２］－键连接而得到，其中Ｐ是指重组人促红细胞生成素，Ｘ是－（ＣＨ↓［２］）↓［ｋ］－或－ＣＨ↓［２］（ＯＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］）↓［ｋ］－，ｋ的数目选自２～１０，ｍ１选自１００～２０００之间的整数，Ｙ选自： ＊＊＊ 其中ｍ、ｎ的数目各自独立地选自２～１０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕爱锋，孙长安，王瑞军，陈克然，李蕴波，王亚里，
申请(专利权)人：江苏豪森药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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