一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法技术

本发明专利技术涉及一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤：将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理１５～３０ｍｉｎ后，转入玻璃化保护剂中进行７０～９０ｍｉｎ的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，１０～１５个茎尖／管，投入液氮中保存即可。本发明专利技术所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后石蒜恢复生长状况良好。对其他鳞茎和球宿根类植物遗传资源的超低温保存来说，具有很好的参考价值。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种营养繁殖花卉石蒜的保存方法，具体的说，涉及一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法。
技术介绍
石蒜属(Lycoris)植物为多年生球根花卉，分布于我国西南至东南部，是我国的珍贵花卉之一。可能是人为传播，或者自然分布、演化的原因，目前从我国东南地区到沿海诸岛、朝鲜半岛、琉球群岛，以及日本的九州、四国和本岛等地方均已报道有其分布，但70％以上的石蒜资源都分布于我国。石蒜开花时无叶陪伴，花茎从裸露的地面出现，并开放出艳丽、硕大的花朵，芳姿独特、艳丽夺目，西方又称之为“魔术花”、“中国郁金香”、“惊喜百合”。除了其重要的观赏价值外，石蒜还有重要的药用价值，其中的重要成分加兰他敏对治疗老年痴呆等神经性疾病有效(Piotrovsky，V.，A.Van.Peer，N.V.Osselaer，M.Armstrong and J.Aerssens.2003.Galantamine PopulationPharmacokinetics in Patients with Alzheimer′s DiseaseModeling andSimulations.The Journal of Clinical Pharmacology，43514-523.)。我国虽具丰富野生资源，但栽培种类单一，繁殖系数不高，药用成份含量低，适用种球严重不足。特别是近年来，以日本为主的东南亚国家，从国内大量收采石蒜属资源，培育繁殖新品种，广泛应用于绿地、花坛绿化。由于人工栽培的石蒜在我国还非常稀少，因此，野生石蒜资源被大量盲目挖采，造成巨大的资源破坏，现有的石蒜资源已经变得十分贫乏。如何有效保存野生资源成为我们面临的新课题。 对于多数能产生种子的植物，基因资源保存的重点是种子的低温干燥保存(Roberts H.F.1973.Predicting the viability of seeds.SeedScience and Technology 1，499-514.)。但是对于以下三类植物，种子保存则行不通。一是根本不产生种子的植物，只能进行营养繁殖；二是块根、块茎类植物，有些是不育的，而有些种类是可育的，能产生传统意义上的种子，但因种子高度杂合，成长后性状高度分离，不能用于基因资源的保存，也只能用营养繁殖来保持纯种基因型；三是有些植物产生顽拗型种子，含水量高，既不能忍受干燥，又不能忍耐低温，很难长期保存。针对这些种子繁殖有问题的植物资源，如百合、石蒜、大蒜、草莓、薯类等难以获得种子的营养繁殖的植物遗传资源，一般通过繁种圃或保存圃的田间种植方式来保存。这种保存方法不仅需要占用耕地、耗时、费力，还存在受干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害的影响以及人工驯化栽培不适的影响而导致种质变异或种质毁灭的危险性，不适应于种质资源的长期保存(Withers L.A.and Engels J.M.M.1990.The test tube genebank-a safe alternative tofield conservation，IBPGR Newsletter for Asia and the Pacific 3，1-2.)。 超低温保存是指在液氮(-196℃)下的低温保存。在此条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择(Engelmann F.1997.In vitro conservation methods.InCallow JA，Ford-Lloyd BV，Newbury HJ(eds)Biotechnology and plant geneticresources.CAB International，Oxford，pp 119-161.)。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。关于植物超低温保存的研究，在进入到上世纪的90年代后，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等薯类植物为主的植物遗传资源的超低温保存(Sakai A andNishiyama Y.1978.Cryopreservation of winter vegetative buds of hardyfruit trees in liquid nitrogen.Hortic Sci 13225-227.)。目前国际上针对石蒜的超低温保存技术尚未确立。 虽然利用超低温保存技术保存植物遗传资源的实践，在上述物种中有了成功应用的报道，但并不意味着任何植物物种或品种具有通用的方法。因为大多数植物材料如悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等，含有大量的细胞间水分，对冷冻伤害特别敏感。特别是植物分生组织、芽端的超低温保存较细胞培养物保存难度更大，原因在于分生组织、芽端的细胞质分布均匀而且稠密，对低温冰冻极为敏感，冰冻过程中的损伤效应特别突出，哪怕是局部的冰冻损伤都会影响冻后的正常分化与再生。同时，分生组织、芽端必须保持结构的完整性才能快速分化。所以，超低温保存面临的课题是尽可能采取更多的、更有效的手段来保证分生组织、芽端在冻存过程中免受损伤。以上特征因物种不同而存在差异，此外，植物离体材料经超低温保存后，因植物种类而异的复苏培养技术的建立也是超低温保存面临的课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理15～30min后，转入玻璃化保护剂中进行70～90min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，10～15个茎尖/管，投入液氮中保存即可。 所述石蒜的鳞茎诱导优选为取石蒜的3～4年生鳞茎，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗若干次后将带3～4层鳞片及部分茎盘的鳞茎切块接种于含3mg·L-1BA及0.5mg·L-1NAA的MS培养基上诱导小鳞茎，培养温度为23～27℃，光照12h·d-1，光照强度36μmol m-2s-1，继代3个月。 所述预培养优选为取诱导后的鳞茎，切取2～3mm大小的同时带有根原基和芽原基的茎尖，接种到含0.4mol·L-1蔗糖的MS培养基内，25℃下暗培养5d。 石蒜优选为红花石蒜(Lycoris radiata Herb)。 所述预处理溶液优选为含有2mol·L-1甘油和0.4mol·L-1蔗糖的MS液体培养基。 玻璃化保护剂优选由3.26mol·L-1甘油、2.42mol·L-1乙二醇、1.9mol·L-1DMSO和0.4mol·L-1蔗糖组成。 解冻后的培养方法优选为取冷冻管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min，茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干后，转移至含0.5mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-1GA3的MS半固体培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤：将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理１５～３０ｍｉｎ后，转入玻璃化保护剂中进行７０～９０ｍｉｎ的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，１０～１５个茎尖／管，投入液氮中保存。

【技术特征摘要】
1、一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理15～30min后，转入玻璃化保护剂中进行70～90min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，10～15个茎尖/管，投入液氮中保存。2、如权利要求1所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于石蒜的鳞茎诱导为取石蒜的3～4年生鳞茎，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗若干次后将带3～4层鳞片及部分茎盘的鳞茎切块接种于含3mg.L-1BA及0.5mg.L-1NAA的MS培养基上诱导小鳞茎，培养温度为23～27℃，光照12h·d-1，光照强度36μmolm-2s-1，继代3个月。3、如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘灶长，林田，李天菲，郑海柔，罗利军，
申请(专利权)人：上海市农业生物基因中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]