新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法技术

一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法，包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理，处理量：０．５ｍｇ／ｋｇ，一日两次，连续３天，低氧条件为小于２０％的氧浓度。本发明专利技术由于应用低氧检测系统和腹腔内注射消炎痛，本发明专利技术的ＰＰＨＮ大鼠模型的构建更加精确与稳定，模型的可复制性也较强；并且我们应用ＢＮＰ间接测定新生大鼠的肺动脉压力，使该模型的构建更加可靠。相对于大型动物ＰＰＨＮ模型的构建过程，此大鼠ＰＰＨＮ模型易于建立，时间周期较短，价廉，方便以及稳定可靠，适于实验室研究应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物领域，涉及一种。
技术介绍
新生 JL 持续性月市动脉高压(persistent pulmonary hypertension of the newborn, PPHN)是指生后肺血管阻力持续性增高，肺动脉压超过体循环动脉压使由胎儿型 循环过渡至正常“成人”型循环发生障碍，导致卵圆孔及(或)动脉导管水平血液的右向左 分流，临床表现为严重的低氧血症，多见于足月儿及过期产儿。PPHN是新生儿重症监护室 的一个重要的临床问题，它在新生儿中的发病率可高达7/1000。机械通气、吸入一氧化氮 (nitric oxide,NO)以及体外膜肺氧合等治疗措施虽然改善了 PPHN的预后，但死亡率仍然 较高。PPHN的病理学特征表现为右心室肥厚、肺动脉中层肥厚、肺小动脉远端肌化、肺毛 细血管密度减少。迄今为止，PPHN发病机制已经从肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞水平进行 了研究，但确切的机制尚未完全阐明。传统的PPHN动物模型可以由低氧、动脉导管关闭、药 物(消炎痛)、胎粪吸入以及内毒素血症等诱导。目前PPHN研究的动物模型大多数基于外 科手术结扎胎羊动脉导管而诱导的。羊PPHN模型可以实时监测肺动脉压力以及可以进行 气管插管以模拟PPHN生后的病理演变过程，但同时也存在一定的缺点，譬如动脉导管结扎 手术难度较大、动物妊娠周期较长、动物购买费用昂贵等。尽管低氧和消炎痛单独处理新生鼠可以诱导类似于PPHN的肺血管结构变化。然 而，Geggel等研究认为单单慢性胎鼠缺氧尚不足以引起与PPHN相似的肺动脉结构改变，而 且直接测定新生鼠肺动脉压力相当困难。近来，脑型利尿肽(brain-type natriuretic peptide,BNP)已逐渐成为一种能够 反映右心室压力负荷的标记物。BNP主要是在容量负荷、压力负荷以及心室应激的情况下由 心室所分泌，而且BNP不能通过胎盘，新生儿BNP水平一般不受母亲条件的影响。因此，BNP 水平可以作为诊断新生儿肺动脉高压的潜在的生物标记物。Reynolds等报道血浆BNP初始 浓度大于550pg/ml可以预测PPHN，其敏感性为83%、特异度为100% ；而且所有的PPHN患 儿血浆BNP浓度均大于835pg/ml。由低氧或消炎痛单个处理因素所诱导的模型已经被研究，然而由低氧联合消炎痛 共诱导的动物模型还没有报道。我们假设，与单个处理因素相比，低氧联合消炎痛处理能够 引起新生大鼠更加显著的肺血管重构。我们也假定新生大鼠血浆BNP水平将能够反映增加 的肺动脉压力，可以间接地反映PPHN模型的建立。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，所述方 法包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理，通过以下步 骤实现建模将体重在250_300g雌性SD大鼠交配过夜(计作d0天)，第二天标记为妊娠第一 天(dl)，该模型中大鼠妊娠期是21天，在妊娠的第19天，孕鼠被随机分为四组开始低氧处 理，即低氧组、消炎痛组、低氧和消炎痛联合处理组以及对照组，所有的处理持续3天，通过 腹腔内输入消炎痛对培养的怀孕动物进行处理；腹腔内输入消炎痛，0. 5mg/kg，一日两次， 连续3天；消炎痛首先溶解在95%的酒精中并用孔径0. 2um的过滤器除菌后4°C保存，在输 入前用注射用水稀释至38%酒精浓度，输入量0. 5mg/kg，一日两次，连续3天。低氧条件下 培养怀孕动物3天，低氧条件为小于20%的氧浓度，优选12%的氧浓度。本专利技术的有益之处是由于应用低氧检测系统和腹腔内输入消炎痛，本专利技术的 PPHN大鼠模型的构建更加精确与稳定，模型的可复制性也较强；并且应用BNP间接测定新 生大鼠的肺动脉压力，使该模型的构建更加可靠，十分适于实验室研究应用。相对于大型动 物PPHN模型的构建过程，此大鼠PPHN模型易于建立，时间周期较短，价廉，方便以及稳定可 靠。本模型采用了测定血BNP的方法来无创评价肺动脉高压，在动物模型中尚没有报道过。附图说明图1为低氧装置。图2为心脏组织HE染色。图3为肺小动脉免疫组化图。图4为肺组织成纤维细胞α -SMA表达。图5为肺组织VG染色图片。图6为肺动脉内皮细胞eNOS表达。图7为肺动脉内皮细胞电镜图谱。图 8 为 Western blot 图片。具体实施例方式本专利技术结合实施例和附图作进一步的说明。实施例11、动物模型的建立体重在250_300g雌性SD大鼠交配过夜(计作d0天)，第二天标记为妊娠第一天 (dl)。该模型中大鼠妊娠期是21天，在妊娠的第19天，孕鼠被随机分为四组开始低氧处理， 即低氧组、消炎痛组、低氧和消炎痛联合处理组以及对照组。所有的处理持续3天。低氧组将孕dl9大鼠放于12%氧浓度的有机玻璃盒中，连续3天。低氧装置参 见图1，是将氮气瓶2中的氮气(约87%)和氧气瓶3中的氧气(约12%)共同通向一个 带有两个小孔的有机玻璃盒1，使得有机玻璃盒1内的氧浓度维持在12%左右，盒内放置有 钠石灰与无水氯化钙(各20-30g/天，每天更换)用于吸收C02与水分。氧浓度由测氧仪 进行持续的检测。消炎痛组消炎痛首先溶解在95%的酒精中并用孔径0. 2μπι的过滤器除菌后4°C 保存。在注射前用注射用水稀释至38%酒精浓度，腹腔注射0. 5mg/kg, 一日两次连续3天。低氧联合消炎痛组将孕dl9大鼠放于12%氧浓度的有机玻璃盒中，并腹腔内注 射消炎痛，0. 5mg/kg, 一日两次，连续3天。对照组置于空气中，并且在孕19-21天时与实验组孕鼠接受相同频率和相同体 积的生理盐水处理。在怀孕第22天，按照50mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉孕鼠并迅速剖腹取 出胎鼠。新生鼠处死后立即取肺并液氮速冻，然后-80°C保存。部分心肺被取出后用福尔马 林4°C固定M小时；组织用石蜡包埋然后切成厚度45 μ m的薄片，用于HE染色、VG染色以 及免疫组化。结果参见图2，(A)对照组、(B)低氧组、(C)消炎痛组、(D)低氧加消炎痛联合 处理组，显示联合处理组右心室壁明显增厚。RV =右心室，LV =左心室。2、动物模型的评价每只胎鼠在分娩后立即测量其体重。心脏被横断面切开，测量右心室游离壁和整 个心脏的重量。通过α-SMA染色测量直径< IOOum和彡IOOum的肺小动脉的中层的厚度， 以及平滑肌所占面积；用eNOS免疫染色分析肺动脉内皮细胞中eNOS表达丰度；用VG染色 方法来研究血管外膜弹力蛋白的相对含量。一个系统随机的抽样方法被用来评估每个变 量，终末细支气管用来作为寻找肺小动脉的标志。Image Pro Plus软件被用来进行上述测 量。(1)免疫组化4-5 μ m厚的石蜡切片用于光学显微镜的免疫组化。切片脱水并转移至含3%过氧 化氢的100%的甲醇中，以除去内源性的过氧化物酶的作用。之后用PBS漂洗切片，用终止 血清终止反应10分钟，然后用主要针对平滑肌特异性的a肌动蛋白(α-SMA)或者内皮一 氧化氮合酶的抗体进行孵育过夜。对照组切片用PBS代替抗体孵育过夜。切片再与二抗山 羊抗体(HRP多聚体37°C孵育30分钟)。加入DAB (3-3' - 二氨基联苯胺)显色剂，就能在 荧光显微镜下看到切片并能观察其颜色变化。每只胎鼠的肺至少取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新生儿持续性肺动脉高压动物模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括在低氧条件下培养怀孕动物，并采用消炎痛对所述怀孕动物进行处理。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜立中，徐雪峰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]