含聚乙二醇蛋白质结合物的药物组合物的制法制造技术

本发明专利技术涉及含有具有生理活性的、基本上无免疫原性的水溶性聚乙二醇蛋白质结合物的药物组合物的制备方法，其中所述的结合物具有至少一部分形成结合物的蛋白质的生物活性，而不产生所述蛋白质的不利免疫反应。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的、蛋白质的聚乙二醇(PEG)结合物。各种天然的和重组的蛋白质都具有医药有用性。一旦它们被纯化、分离和配制后，它们便可经非经胃肠途径给药来用于各种治疗适应征。然而，非经胃肠道途径给药的蛋白质可能具有免疫原性，可能是相对不溶于水的，也可能具有短的药理学半寿期。因此，要在病人体内使蛋白达到有治疗作用的血液水平，可能是困难的。将蛋白质与聚合物如聚乙二醇结合，可以克服这些问题。Davis等人在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质如酶和胰岛素结合以得到结合物，其中的蛋白质免疫原性较小并保留了大部分生理活性。Nakagawa等人在美国专利4,791,192中公开了将PEG与胰岛活化蛋白质结合以降低其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.and Biotech，11，141-152(1985)中公开了用氯甲酸苯酯类化合物活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和过氧化物歧化酶。Katre等人在美国专利4,766,106和4,917,888中还公开了通过聚合物结合作用而使蛋白质增溶。将PEG和其它聚合物与重组蛋白质结合可降低免疫原性，增大半寿期。参见Nitecki等人的美国专利4,902,502；Enzon，Inc.的国际申请PCT/US 90/02133；Nishimura等人的欧洲专利申请154,316以及Tomasi的国际申请PCT/US 85/02572。King等人在Int.Archs.Allergy appl.Immun.66，439-446(1981)中描述了一种用O-(RO-PEG)-S-甲酰氨基甲基-二硫代碳酸酯中间体使蛋白质与PEG键合的方法。形成PEG-蛋白质结合物的先有方法和由所述方法产生的结合物存在着一些问题。其中包括，形成这些蛋白质-PEG结合物的某些方法可能会使蛋白质失活，使得产生的结合物生物活性可能很差。此外，在形成这些PEG-蛋白质结合物时所用的某些键合剂可能易于发生体内水解裂解。如果给药后发生这样的裂解，这些结合物便失去了由PEG提供的有益性质。本专利技术通过使用独特的键合剂提供了新的PEG-蛋白质结合物，所述键合剂使蛋白质中的各个游离氨基与PEG连接起来，这样就避免了蛋白质与PEG形成结合物时带来的问题。具体讲，本专利技术提供了具有生理活性的下式所示的蛋白质结合物中 式中R1为低级烷基；R2为-O-或-NH-；R3为＝N-R4、＝S或＝O；R4为低级烷基或环烷基；m和n选自≥1的整数，并要使结合物具有至少一部分非结合蛋白质的生物活性；条件是，当R2为-O-时，R3不是＝N-R4；当R2为-O-、R3是＝O时，蛋白质为α-干扰素、白细胞介素-1或白细胞介素-1ra；以及当R2为-O-、R3为＝S时，蛋白质不是得自豚草花粉或牛血浆清蛋白的E抗原。更具体地讲，本专利技术提供了下列各式所示的蛋白质结合物 式中R1、R4、m、n和蛋白质如上所述。根据本专利技术，我们还首次提供了与PEG结合的蛋白质白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和白细胞介素-1(IL-1)。根据本专利技术，式I的蛋白质结合物通过使活化的PEG(即其中一个羟基已被活化的键合剂置换了的PEG)与蛋白质中的一个或多个游离氨基缩合来产生。用来生成结合物的活化PEG化合物具有下列各式结构II-A R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝C＝N-R4 II-D R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N＝C＝S 式中R1为低级烷基，R4为低级烷基或环烷基，R5为低级烷基或H，n为1～1000的整数。根据本专利技术，通过使用式II-A、II-B、II-C、II-D、II-E、II-F或II-G的活化PEG化合物产生结合物，在蛋白质的游离氨基和PEG之间形成了连接键，结果使所形成的结合物保持了蛋白质的至少一部分生物活性，同时降低了其免疫原性。此外，通过使用式II-A～II-G所示的任何一种活化聚乙二醇在本专利技术的结合物中形成的连接基团，所产生的蛋白质结合物不易发生体内水解裂解，并且没有在先有技术的PEG-蛋白质结合物中存在的许多缺点。根据本专利技术，R1和R5可以是任何低级烷基，优选甲基。“低级烷基”一词意指含有1～6个碳原子的低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基等。通常，优选的烷基是含有1～4个碳原子的低级烷基，最优选的是甲基。根据本专利技术，m和n可以选自≥1的任何整数，并要使产生的蛋白质结合物具有至少一部分形成结合物的蛋白质的生物活性。显然，m和n的总和与结合物保持的蛋白质生物活性的量成反比。n的数值关系到形成结合物的聚乙二醇中乙二醇单元的数目，为1～1000。m涉及与活化PEG反应的蛋白质中所含的游离氨基的数目。m优选为1～5，最优选为1。m+n的值越大，结合物的分子量就越大。本
中的专业人员可容易地测得式II-A～II-G的聚乙二醇聚合物的分子量及式I和式I-A～I-E的蛋白质结合物的分子量。从测得的分子量可以推算出m和n的值。“蛋白质”一词不仅包括多肽，而且也包括生理上可接受的加成盐。当式II-A～II-G任何一式所示的化合物与蛋白质反应，而蛋白质含有一个以上游离氨基时，所得到的结合物为各种蛋白质-PEG结合物的混合物。在蛋白质含有两个游离氨基的情况下，活化的PEG既可以与其中一个游离氨基反应，也可以与两个游离氨基都反应。在这种情况下，混合物含有两种结合物，其中一种是由两个游离氨基与PEG反应形成的，而另一种是仅有一个游离氨基与PEG反应形成的。由于该混合物中的各种结合物具有不同的分子量，所以可以通过诸如层析法之类的常规方法分离这些结合物。为了m和n选择得是否合适，可以对分离出的结合物进行生物活性筛选，以确定该结合物是否仍保持有一部分形成该结合物所用的蛋白质的生物活性，筛选方法与筛选母体蛋白质时所用的方法相同。这样，便可以以任何所希望的方式调整m和n的数值，得到所希望的活性。根据本专利技术的优选实施方案，m和n可为任何整数，只要结合物的分子量(不包括蛋白质的分子量)为大约300至大约30,000道尔顿。根据该优选实施方案，m为1。如果m为1，那么即使存在两个或更多个游离氨基，也可以得到该结合物。活化的PEG化合物首先与蛋白质中所含的游离氨基之一进行反应。通过调节各试剂如蛋白质的浓度和反应条件，按照一般的胺缩合方法，便可以调节蛋白质中所含的游离氨基的聚乙二醇化(pagylation)的程度。在含有一个或多个游离氨基的蛋白质中，如果游离氨基中的一个比其它的游离氨基活泼，那么可以选择条件使蛋白质与活化的PEG化合物反应形成其中m为1的式I化合物。然后通过延长缩合反应或使用其它更剧烈的反应条件，可以使形成蛋白质的氨基酸中所含的其它游离氨基与PEG反应。根据m为1的优选实施方案，n可为任何整数，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～30,000道尔顿，这相应于n为大约6～680。更优选地，n为大约28、112和225，这分别相应于分子量为1325、5000和10000，而最优选的是n为112左右。由于通常由其平均分子量而不是其自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备含有具有生理活性的式Ⅰ所示的蛋白质结合物的药物组合物的方法， ＊＊＊ Ⅰ 其中 Ｒ↑［１］为低级烷基； Ｒ↑［２］为－Ｏ－或－ＮＨ－； Ｒ↑［３］为＝Ｎ－Ｒ↑［４］、＝Ｓ或＝Ｏ； Ｒ↑［４］为低级烷基或环烷基； ｍ是１或２， ｎ为大约２８、１１２和２２５； 其中所述的蛋白质是白细胞介素－１、白细胞介素－１ｒａ、α－干扰素或白细胞介素－２； 前提是，当Ｒ↑［２］为－Ｏ－时，Ｒ↑［３］不是＝Ｎ－Ｒ↑［４］；当Ｒ↑［２］为－Ｏ－、Ｒ↑［３］为＝Ｏ时，蛋白质不是白细胞介素－２； 所述方法包括，将一种或多种所述的式Ⅰ蛋白质结合物以及需要的话一种或多种其他有治疗价值的物质制成合适的制剂形式。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J哈基米，P基利恩，P罗森，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]