一种稳定的,干燥的血液因子组合物,其含有稳定化量的海藻糖,不含有白蛋白。(*该技术在2016年保护过期,可自由使用*)
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血液因子的干燥的组合物,用于用水或水溶液重建(reconstitution)。血液因子,特别是因子VIII和因子IX,是目前治疗由缺少适当因子引起的疾病,特别是血友病的标准治疗药剂。血液因子一般是通过各种提取技术来源于人的血液的,例如EP-A-0083483中所公开的,或者通过在基因修饰的微生物中表达得到,例如EP-A-0160457和EP-A-0182448中所公开的。血液因子制品(例如因子VIII)是非常敏感、不稳定的蛋白。它们通常是以溶于合适的缓中液中的,冰冻的溶液的形式提供的,更一般地,它们是以冻干的粉末形式提供的。但甚至冻干的粉末在保存时也必须保持在低温下。为了使冻干的物质稳定,商业制品含有稳定化蛋白,特别是人血清白蛋白(HSA)。制备在环境温度和巴氏消毒(例如60℃)下稳定的,不合HSA的干燥的血液因子组合物被认为是不可能的。但是,HSA的存在将带来不可忽视的纯化方面的问题,因为蛋白不被病毒污染这一点是必需的。克服这些问题的重组HSA的应用是昂贵的。已知海藻糖是敏感蛋白的高效稳定剂,如US-A-4891319中所公开的,能够使蛋白在冰点以上的温度干燥。我们现已发现,在完全不含有HSA的条件下,如果用海藻糖来稳定血液因子制品,该制品不仅可以在冷冻或不冷冻的条件下干燥,并且甚至在60℃温度下持续一定时间后也是稳定的。因此,根据本专利技术,我们提供了稳定的干燥的血液因子组合物,该组合物含有稳定化量的海藻糖,不含有白蛋白。通常可以应用任意稳定化量的海藻糖,过量一般不会带来问题。实际上,海藻糖的存在有助于再水化过程,它用于注射时是生理可接受的,能够迅速地被代谢成葡萄糖。该组合物对因子VIII的制剂是特别适用的,该制剂也可包含适当的缓冲盐或离子增强盐,特别是钙源。一般地,每单位的因子VIII对应大约1.0至1.5毫克钙离子的比率是合适的。其他缓冲或改性剂(例如组氨酸)也可存在于干燥的物质中,用于重建成注射液。但是,我们发现盐(特别是氯化钠)的存在水平可影响干燥制品的保存性。用于注射的商业制品被认为需要具有等渗盐浓度。但是,冻干的制剂最好是高渗的,典型地含有大约500mM NaCl(等渗NaCl=150mM),这被认为有助于稳定血液因子。结果,商业性冻干制剂通常具有高的盐含量,需用合适量的无菌水重建以得到等渗的溶液用于注射。显著减少的盐含量对本专利技术的干燥的物质是优选的,需要干燥的每毫升大约500单位的因子III溶液通常优选地含有少于200mM,例如75-150mM的NaCl,特别是大约100mM,或者甚至低于例如20-50mM,特别是大约22-30mM。低盐制备物具有更高的干燥稳定性。可用盐溶液而不是常规的水将干燥制品重建到所需的盐浓度。海藻糖与盐的摩尔比通常应当高于1∶1,特别是高于2.5∶1,例如高于10∶1,优选地高于12.5∶1。可通过干燥血液因子的适当溶液得到干燥的组合物,所述血液因子溶液含有正确比例的海藻糖和其他所需的成分。通常,被干燥的溶液应仅仅含有重建的注射溶液中所需的全部成分,虽然用于干燥的溶液不必处于同样的稀释度。典型地,每毫升用于干燥的溶液含有1-1000单位的因子III。干燥的方法可包括冻干、真空干燥和喷雾干燥。本专利技术特别优选的方法包括在不高于25℃,优选不高于10℃的温度下进行真空干燥,以形成泡沫,使暴露表面和干燥效果最大化。下述实施例将进一步阐明本专利技术。实施例1重组的因子VIII是以深度冷冻溶液的形式得到的,含有大约2000-2500单位/毫升,溶于制造者的高盐缓中剂中。融化的溶液被透析,所用缓中液含有500mM NaCl,15mM CaCl2和10mM组氨酸,pH6.8。在同样缓冲液中稀释透析后的蛋白,但是加入海藻糖,终浓度为每毫升500单位,10%重量比的海藻糖,pH6.8。该溶液以1毫升的等分试样被真空干燥。真空度从大气压逐级减少到4Pa(30mTorr),以避免样品冷冻。在形成泡沫之前,样品的温度不允许超过12℃,在形成泡沫之后,温度保持在低于30℃。总的干燥时间是24小时至28小时。样品在40℃下保存0、1.5、3和6个月,然后在进行活性检测之前用5毫升等分试样的无菌蒸馏水重建。结果显示于下表,与含有HSA的商品化冻干制品进行对比。受试样品和商品化样品都具有高的盐含量。干燥后的结果显示,在不含有HSA而含有海藻糖的条件下,虽然可以成功地干燥因子VIII,但即使在含有HSA时,高的盐含量对于长期保存也是不利的。初始活性的百分数 </tables>实施例2如实施例1所述干燥样品,但所使用的缓冲制剂包含100mM NaCl,15mM CaCl2,15mM组氨酸和1.27摩尔海藻糖(48%),并在重建之前保存在60℃。结果显示在下表中,其中活性是在ACL 100自动凝度计(Instrumentation Laboratory SpA,Milan,Italy)上测量的。即使在60℃下保存4周之后,具有低盐含量的受试样品也没有显示出明显的活性损失。恢复的初始活性的百分数 </tables>实施例3制备含有如下不同盐浓度的两种制剂制剂A制剂BNaCl 0.13%NaCl 1.03%CaCl20.011% CaCl20.011%L-组氨酸 0.12%L-组氨酸 0.12%Tris 0.002% Tris 0.002%Tween 80 0.002% Tween 80 0.002%PEG 3350 0.004% PEG 3350 0.004%海藻糖7.5% 海藻糖 7.5%因子VIII 50U/ml因子VIII 50U/ml加水至100% 加水至100%将10毫升的制剂分配到各个30毫升的瓶中,使得因子VIII的浓度为500单位/瓶。冻干是在Laconco(Lyph-lock 12 stoppering)冻干机中进行的。开始时,样品被冷却至-40℃,然后在加温至-35℃之前被置于真空。80小时之后,以2.5℃/小时的速率将样品加温,直到搁板温度达到25℃。然后在封闭之前,在真空下将样品保持在25℃两小时,并从干燥机中移出。干燥之后,用10毫升水将样品重新水化,测定两次(测定1和2)因子VIII的浓度。结果由下表给出,以因子VIII浓度相对于预补充(prefill)对照(在-70℃下冷冻)的百分数表示。从该结果可以看出,因子VIII可以在不含有HSA的,基于海藻糖的制剂中被成功地冻干。 </tables>权利要求1.一种稳定的,干燥的血液因子组合物,其含有稳定化量的海藻糖,不含有白蛋白。2.权利要求1的组合物,其中每单位的血液因子含有0.15至2.5毫克的海藻糖。3.权利要求1或2的组合物,其含有因子VIII。4.权利要求3的组合物,其中每单位的因子VIII含有1.0至1.5毫克的钙离子。5.权利要求1至4中任一权项的组合物,其中每摩尔盐含有超过2.5摩尔的海藻糖。6.权利要求5的组合物,其中每摩尔盐含有超过10摩尔的海藻糖。7.一种制备权利要求1至6中任一权项的组合物的方法,其中含有海藻糖的血液因子的水溶液是在不超过25℃的温度下被干燥的。8.权利要求7的方法,其中溶液是在不超过10℃的温本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:B·J·罗色尔,
申请(专利权)人:廓德伦特控股剑桥有限公司,
类型:发明
国别省市:
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