含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物制造技术

本发明专利技术提供了一种通过调节免疫系统治疗哺乳动物疾病的药物组合物，它含有治疗这种疾病有效量的ＣａＮＢ亚基和／或其功能衍生物。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有钙调神经磷酸酶B亚基(CaNB)的药物组合物。钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)是目前所知唯一依赖钙，钙调素(calmodulin，CaM)的蛋白磷酸酶。70年代末，80年代初首先在哺乳动物脑内发现并得到纯化。后来在人，兔的非神经组织乃至某些肿瘤细胞中均有发现。CaN的分子量是80KD，由催化亚基A(61KD)和调节亚基B(19KD)按1∶1组成。(Klee，C B et al.，The calmodulin regulated proteinphosphatase molecular aspects of cellular regulation，1988，Vol 5，p225)。CaNA亚基是全酶催化和调节的核心。生物化学研究表明，它至少包含了4个结构域与金属离子的结合区(或催化区)，与调节亚基B(CaNB)的结合区，与调节剂CaM的结合区及自抑制区。催化部位在A亚基上的最有力证据是将A，B二亚基分离后，A亚基仍表现出蛋白磷酸酶的活性。CaN在蛋白磷酸酶分类中属丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。命名为蛋白磷酸酶2B，其催化亚基A和此家族的其他成员特别是蛋白磷酸酶1，2A等有很高的同源性。这主要发生在它们的催化区域，因此它们的催化机制极其相似。但每种磷酸酶有着不同的调节区域和亚基，因而产生出结构和功能的差异。CaNA亚基与其他磷酸酶不同的是它的C末端多出170个氨基酸序列，此序列为B亚基结合区，CaM结合区和自抑制区，它们都与调节CaN磷酸酶的活性有关。人的CaNB亚基由169个氨基酸组成，它是钙结合蛋白家族中的一员，其一级结构与CaM，肌钙蛋白C等非常相似，与CaM的序列有31％-35％的同源性。并也有4个EF手的钙结合区域。钙离子结合区的氨基酸序列有更为高度的保守性。CaNB亚基与CaM的空间结构也极其相似，都包括了两个球型的，分别含有2个结合钙的结构域和连接两个结构域的中心α螺旋。与CaM不同的是CaM的两个球型钙结构域位于中心α螺旋的两侧，而CaNB亚基的两个球型钙结构域通过中心螺旋在85位甘氨酸处发生急剧转变，连同C末端的β链形成了一个疏水凹槽。使这两个球型钙结构域覆盖在其上侧，而CaNA亚基的B亚基结合中心螺旋(BBH)中的疏水氨基酸就结合在这个疏水凹槽中，成为CaNA，B二亚基结合的结构基础。(Kissinger，CR et al.，Nature，1995，378；641；Griffith，JPet al.，Cell，1995，82507)。另一个与CaM不同的是CaNB亚基N末端的甘氨酸上连接有一个十四碳的脂肪酰基团。B亚基不具有蛋白磷酸酶的活力，但对于维持CaN酶活性是高度专一的。虽然CaNB亚基和CaM对CaNA亚基的活性具有协同调节作用，但二者对酶活力的调节是不可互相代替的。目前所知最主要的一点是B亚基通过降低催化亚基A对底物的Km来调节CaN的活性。(Perrino，BA et al.，J.Biol.Chem.，1996，270340)。CaN是保守蛋白，广泛分布在真核生物中。从人，大鼠，小鼠，猪，蛙，鱼，鸡等的脑匀浆中以及人，兔等的非神经组织中均检出了CaN。从果蝇胚囊粗提物中检出了B亚基，但没有检出A亚基。在海胆卵中发现了一种受CaM调节的蛋白磷酸酶，它与CaN有着相同的亚基组成，它的小亚基与CaN的B亚基有着相似的肽图谱，但它的大亚基肽图谱与CaNA亚基的肽图谱不同(Klee，CB et al.，Adv.Enzymol.，1987，61149)。表明B亚基比A亚基更具保守性。我们曾用小鼠CaN抗体检测人脑及其他肿瘤中的CaN，结果发现，在我们检测的一些肿瘤如人脑胶质瘤，脑膜瘤等中均有B亚基的存在，含量还相当可观。但A亚基很不明显。小鼠H22肝癌腹水中CaNA，B二亚基均能检测到，但B亚基量大于A亚基。(魏群等，生物化学杂志，1993，9240)。CaN在肿瘤组织中的存在和作用还值得进一步研究和探讨。从分子生物学研究来看，已经从人，大鼠，小鼠，兔脑等组织的基因文库中分离到几个CaN cDNA克隆，真核组织中CaNA有3种基因编码，分别命名为CaNAα，β，γ。其中Aα，Aβ分别定位在人类4号和10号(10q21-q22)染色体上，CaNB亚基高度保守，目前只发现一种CaNB基因，定位于人的2号染色体(2p16-p15)上。(Wang，MG et al.，Cytogenet.CellGenet.，1996，72236)。CaNA，B两亚基哺乳动物的cDNA虽早在80年代末，90年代初就已经问世，但在大肠杆菌中如何表达出高含量，有活性的酶却迟迟不能解决，有在昆虫细胞或其他细胞中表达的，有表达出来以包涵体形式存在的，纯化步骤繁杂，得率很少。或A，B两亚基共同表达。而我们进行了CaNA，B两亚基在大肠杆菌中的分别表达，尤其是CaNB亚基的表达量极大，纯化步骤极其简单。人CaNB亚基和大鼠，牛等哺乳动物均同源，这些均为CaNB亚基的药用奠定了坚实的基础。CaN有许多重要的生物学功能。由于它是唯一依赖钙，钙调素的蛋白磷酸酶，所以在钙离子信号传递涉及其底物可逆磷酸化的生理，病理过程中都起着重要的作用。又因CaN在脑内的极高含量，许多脑内功能都与之有关。目前最引人注目的是它和学习记忆，老年性痴呆等的关系。最近发现CaN又是T细胞活化中的关键酶。CaN是T细胞活化中关键酶的证据是证明了它是不同免疫抑制药物如FK506，环胞霉素A等的体内共同靶酶，而且已研究了它在T细胞活化中的作用。研究表明转录因子NF-AT是CaN的底物，而且证明了CaN和NF-AT是结合成复合物从胞浆转移到核内的(Shibasaki，F et al.，Nature，1996，382370)。NF-AT在核内的作用已很清楚，它结合于白介素2(IL-2)基因启动子区，促使IL-2的转录表达，IL-2再从细胞中分泌出来，结合于T细胞表面的IL-2受体，从而刺激T细胞的增殖。目前进行的CaN生物功能研究都是基于CaN具有蛋白磷酸酶活性这一特性，进行的实验大部分是在CaNA，B二亚基共同参与下完成的，少数实验是在CaNA亚基或CaNA亚基的突变体单独存在时完成的。有论文对CaNB亚基在完成生物功能中的作用有所论述，特别是免疫抑制剂FK506和FKBP-12及环胞霉素A和其结合蛋白与CaN结合时有人认为B亚基起了重要作用(Li，W et al.，J.Biol.Chem.，1993，26814040；Milan D，et al.，Cell，1994，79437；Kawamura A et al.，J.Biol.Chem.，1995，27015463；Griffith，JP et al.，Cell，1995，82507)，但认为在此作用中仍需要CaNA的参与。目前为止没有看到用CaNB亚基单独注入体内产生生理效应的报导，更没有看到CaNB亚基能作为抗癌药及生物反应调节剂的报导。机体免疫状态与肿瘤发生发展有着密切的关系，Burnet于1970年提出免疫监视的概念。其主要论点是“免疫功能部分是作为阻止体细胞突变产生癌细胞的机制而进化的。”即哺乳动物主要是通过T淋巴细胞来识别和消灭体内癌变的。近年来关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗哺乳动物疾病的药物组合物，它含有治疗这种疾病有效量的ＣａＮＢ亚基和／或其功能衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏群，严明山，高钦山，姜国华，连慕兰，陈燕，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]