肿瘤基因开关药物制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤基因开关药物的是由一段序列特异的ｄｅｃｏｙ核酸组成的药物，此类核酸可在细胞内特异地结合某些癌基因的转录调控因子，阻抑这些癌基因的过度表达，从而抑制肿瘤细胞生长，可发展成为肿瘤基因治疗的药物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

肿瘤治疗药物。上游的调控基因即是表达细胞核因子(DNA结合蛋白)的基因，包括肿瘤发生相关的原癌基因和抑癌基因。由于某些外界因素作用下，原癌基因激活而过度表达和抑癌基因的失活。即调控基因发生失控紊乱，本身表达调控失常，并引发其他下游基因调控及表达失常的连锁反应，导致肿瘤发生，因此，原癌基因、抑癌基因是肿瘤基因治疗的重要靶点。肿瘤细胞一个特征是原癌基因过度表达，其中c-myc在髓性白血病、B淋巴瘤、T淋巴瘤、肉瘤等多种肿瘤均有高表达，并在白血病、乳腺癌、胃癌、小细胞肺癌、结肠癌、神经细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞癌均有不同程度的扩增。在人肝癌细胞低甲基化引起过度表达。c-fos在骨肉瘤、淋巴瘤等过度表达。c-jun在小细胞性肺瘤和非小细胞性肺癌、结肠直肠癌高表达。在肿瘤的启动、促瘤阶段，有c-myc、c-jun的高表达(与肿瘤发生有关)。肿瘤细胞另一特征失去细胞周期特异性，失去对细胞增殖信号的反应能力，而c-myc过度表达是细胞增殖的前提之一。MYC-MAX异二聚体结合于E-box，激活本身及下游通讯基因CYC25A等表达，形成细胞增殖表型，并与E2F共同作用，激活cyclinA、cyclin E，在细胞周期中G1→S期的转化是起关键作用。c-myc还可活化端粒酶的表达，在促进肿瘤形成上起重要作用。c-jun和c-fos在RAS信号传导途径的下游核相中起重要作用。(被称为早期快速反应基因或第三信使)。c-myc和c-fos在细胞分化中起重要作用。此外，c-myc、c-fos、c-jun在细胞凋亡、基因组稳定、细胞成熟中有重要作用。因此，改变c-myc、c-fos、c-jun的调控异常，从而可以改变恶性增殖表型为良性表型，原癌基因和抑癌基因在正常细胞和肿瘤细胞同时存在，不同的是两类细胞中的表达程度不同，肿瘤细胞是原癌基因过度表达，是正常细胞的2～10倍，且抑癌基因失活。这说明基因的表达调控出现了异常，这种异常是基因的调控区上顺反式因子结合状态及数量的发生了改变，如何消除这种异常，改变基因调控状态，目前世界上有一种新的策略即转录因子“诱饵”(decoy)的方法，用特异性的DNA序列结合转录调控因子(包括原癌基因上增强子上的转录激活因子和抑癌基因沉默子上的转录抑制因子)，改变调控基因的表达状态，从而改变细胞表型。人们在DNA与蛋白质相互作用关系的基础研究中，已发现并证实体外合成一段序列特异的短链DNA，可与细胞核蛋白提取物中某一种因子结合，在聚丙烯酰胺电泳中产生凝胶阻抑现象，为现在decoy核酸发展成为药物提供了实验基础。自从90年代来，Bielinska(1990)提出用双链寡聚核酸调控基因表达以来，decoy核酸已首先用于在治疗心血管药物开发，用E2F因子的decoy核酸治疗静脉搭桥术后血管的内膜增生(Mann.et al1999)已进入临床，用NF-Kappaβ的decoy核酸防治心肌梗塞(Sawa.1997.Tounita.1998)，还有AGE、SRF的decoy核酸等。decoy核酸应用于肿瘤治疗刚处于起步阶段，如CREB因子的decoy核酸(Cho-chong 1999)已在多种肿瘤细胞株及动物模型开展。ER的decoy核酸(PivaR et al 2000)用于抑制乳腺癌细胞生长。NF-Kappaβ的decoy核酸(Sharma.HW etal)在小鼠纤维瘤体内外试验取得一定抑制效果。本专利技术的另一目的是提供含有本专利技术decoy核酸药物组合物。本专利技术的另一目的是本专利技术decoy核酸用于制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术的目的可以通过以下措施来达到肿瘤基因开关药物的设计是将转录因子特异结合的序列作为药物decoy核酸的核心序列，并适当增加核心序列的侧翼长度，使其易形成空间结构，以加强药物的稳定性及与靶因子的亲和力。药物KGCD101A系列是为调控原癌基因C-FOS的过度表达而设计的。根据原癌基因C-FOS的调控区结合了多个因子，如SRF、CREB、AP-1、SIF因子等，其中CREB因子的结合位点CRE增强子序列STGACGTMR(序列1)作为药物decoy核酸的核心序列，竞争结合CREB，下调原癌基因C-FOS的表达。例如药物KGCD101a(序列6)由34个核苷酸组成，含此核心序列，并具有发夹结构。另如药物KGCD101a-1也可以是由含此核心序列的序列7和序列8组成，48个核苷酸，两个序列结合成双链过程中形成十字形结构。药物KGCD101a-2是由序列7与序列9形成T形结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以STGACGTMR为核心序列，核苷酸总数为15-55个。并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。药物KGCD101B和KGCD101C系列是为调控多种原癌基因而设计的。FOS-JUN形成异源二聚体，成为AP-1转录激活因子，其结合于多个基因的顺式元件STGASTMA(序列2)上，激活多种基因的表达。采用该序列为药物decoy核酸的核心序列，下调含AP-1增强子基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。例如药物KGCD101b由序列10和序列11构成的，含此核心序列，核苷酸总数为42个的双链DNA分子。药物KGCD101b-1(序列12)，有35个核苷酸并含此核心序列，具有发夹结构。药物KGCD101b-2(序列13)有42个核苷酸并含此核心序列，具有哑铃结构，可用连接酶使5′和3′端连接成闭环，以增加药物稳定性。药物KGCD101C由序列14和序列15组成，其核苷酸总数为42个，含此核心序列，具有十字形结构。药物KGCD101c1由序列16和序列17组成，其核苷酸总数为44个，含此核心序列，具有十字形结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以STGASTMA(序列2)为核心序列，核苷酸总数为15-55个‘并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。药物KGCD102系列是为调控原癌基因c-jun而设计的。根据c-jun自身活化表达的作用。c-jun蛋白结合自身基因的增强子序列TTACCTCA(序列3)，该序列作为药物KGCD102系列的decoy核酸的核心序列，下调c-jun表达。例如药物KGCD102(序列18)为含此核心序列，核苷酸总数为37个，具有发夹结构的此类decoy核酸药物之一。另有药物KGCD102-1(序列19)为40个核苷酸，具有发夹结构。药物KGCD102-2(序列20)为38个核苷酸，具有哑铃结构。药物KGCD102-3(序列21和序列22)为54个核苷酸，具有茎环结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以TTACCTCA(序列3)为核心序列，核苷酸总数为15-55个，并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。药物KGCD103a系列是为调控原癌基因C-MYC而设计的。根据C-MYC与自身增强子TCTCTTA(序列4)序列结合，将此核心序列作为decoy核酸药物的基本组成，下调C-MYC基因表达。例如药物KGCD103a由序列23和序列24形成的双链DNA组成，52个核苷酸含此核心序列。药物KGCD103a-1(序列25)有含此核心序列的35个核苷酸，发夹结构。本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一种肿瘤基因开关药物，该药物的组成特征为一段序列特异的寡聚脱氧核糖核酸，其分子一级结构由含有ＳＴＧＡＣＧＴＭＲ核心序列的１５－５５个核苷酸组成，并可以通过自交或互交形成双链、进而形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构，包括序列６－－－序列９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青，王雪根，陈武领，冯莹，
申请(专利权)人：南京凯基生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]