本发明专利技术公开了一种抗菌活性物的制备方法，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＪＵ１５，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：２０１０年４月８日，保藏号：ＣＣＴＣＣ：Ｍ２０１００７４；依次包括以下步骤：１）制备发酵液；２）将发酵液离心、加入固体硫酸铵等处理后，得抗菌粗提液；３）将上述抗菌粗提液经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Ｍｉｌｌ Ｑ水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。本发明专利技术方法制备而得的抗菌活性物用于抑制或消灭单增李斯特菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株枯草芽孢杆菌菌株ZJU15--Bacillus subtilis ZJU15，以及由其发酵产生的抗菌活性物及相应的制备方法和用途。
技术介绍
食物是人类生存和社会发展的第一物质基础，而食品(农产品)安全是全世界共同关注的问题，其中，食品防腐保鲜则是食品安全的一个关键。目前普遍使用的化学食品防腐剂潜在的安全隐患不容忽视，但经长期的研究，发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康的日益关注，人们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求，高效安全的天然食品防腐保鲜剂的开发与应用是食品科学研究的发展趋势。至今，国内外已从动物、植物和微生物等各种生物资源开发溶菌酶、乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)、ε-聚赖氨酸、茶多酚、香精油、大蒜素、鱼精蛋白、蜂胶、壳聚糖等一系列可作为天然食品防腐保鲜剂的产品，但由于原料来源、本身的产品性能、制备工艺和价格等多种因素的限制，目前仅乳酸链球菌(Lactococcus lactis)菌株产生的乳酸链球菌素等少数微生物源品种获得了市场的广泛认可，得到了较大规模的使用。乳酸链球菌素是由部分乳酸链球菌菌株产生的细菌素，由34个氨基酸组成，可抑制多种革兰氏阳性细菌的生长繁殖，并对人体安全无毒。但nisin在生产应用中存在其局限性，如它的最适活性pH值为3，在碱性条件下溶解度很少，稳定性也差；食品的化学组成和物理性质也可显著影响Nisin的活性，如新鲜肉中含有的谷胱甘肽能显著降低乳酸链球菌素的活性，而且肉本身较高pH和磷脂等成分也降低了它的抗菌效果，此外，国际上已发现李斯特菌等多种食品腐败革兰氏阳性细菌诱变后可对nisin具有较大的抗性。开发新的高效安全的天然食品防腐保鲜剂是保证食品(农产品)安全的一项重要的任务。 同时，自1941年弗莱明从青霉菌中发现第一个广谱抗生素--青霉素以来，链霉素、氯霉素、红霉素、利福霉素、万古霉素等不同化学结构类型和不同生物活性的抗生素相继问世，抗生素在临床上的应用成为治疗细菌感染的主要手段，从而挽救了无数人的生命。 然而随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性问题也随之越来越突出，病原菌耐药性成为感染性疾病引起死亡的主要原因之一，这给临床治疗带来了严重的挑战。研究和开发新的抑制病原菌的药物变得非常紧迫。 在天然抗菌物质中，有一大类属于肽类抗菌剂，它们与抗生素在化学本质、产生机理、抑菌机理和免疫原性等方面显著不同，其高效安全，而受到人们广泛关注，其中微生物抗菌肽发酵周期短、生产成本低、抑菌效果好，因此成为研究热点领域。枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，其中以抗菌肽类为主：一类是核糖体合成的羊毛硫抗生素(bacteriocin)，已经鉴定的有：subtilosin、ericin、mersacidin、subtilin和sublancin等，它们都是由核糖体编码翻译成前导肽后，经过肽酶剪切、翻译后修饰形成成熟活性多肽。其中subtilin、ericin为一类具线性结构、碱性、长约34个氨-->基酸残基、具有相似的羊毛硫桥的短肽，mersacidin、sublancin、subtilosin呈略碱性或中性、长约19氨基酸残基、C-末端残基参与共价结合形成类似球形环状的短肽。另一类为非核糖体合成脂肽类(lipopeptides)，已经鉴定的有：surfactin、iturin和fengycin等三个家族。这些脂肽的分子结构由环状的7个氨基酸(surfactin和iturin)或10个氨基酸(fengycin)分别与一个脂肪酸链连接而成。Surfactin的脂肪酸链长度变化由C13到C16，iturin由C14到C17，fengycin由C14到C18，因此每一种脂肽类化合物都有多种同系物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用枯草芽孢杆菌制备而得的抗菌活性物及其制备方法和用途。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种抗菌活性物的制备方法，该枯草芽孢杆菌保藏名称为：Bacillus subtilis ZJU15，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月2日，保藏号：CCTCC NO：M2010074；依次包括以下步骤： 1)、制备发酵液： 取保存于-70℃的Bacillus subtilis ZJU15 CCTCC NO：M2010074接种于LB培养液(LB液体培养基)中，30℃、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液； 将上述种子培养液以5％的体积比浓度接种于LB培养液中，在30℃、200rpm/min振荡培养30小时，获得发酵液； 2)、将发酵液以6000～8000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照10.5～11.5g硫 酸铵/100ml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0℃～4℃下放置10～14小时；然后再以11000～14000rpm/min离心10～20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20(v/v)；然后再以11000～14000rpm/min离心取上清，即得抗菌粗提液； 3)、将上述抗菌粗提液经Sephadex G-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。 作为本专利技术的抗菌活性物的制备方法的改进：Superdex 75 prep grade柱层析方法为：将0.5ml枯草芽孢杆菌ZJU15的抗菌粗提液经冷冻真空干燥后，重新悬浮于0.3ml洗脱溶液A中，上样进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为1.0mL/min，按照1ml/管的格式分管收集洗脱液，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4℃透析6次，每次2h，然后冷冻真空干燥。 作为本专利技术的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，LB培养液为：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121℃灭菌20分钟，pH7.0。 蛋白胨可购自Oxoid公司，酵母提取物可购自Oxoid公司。 作为本专利技术的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，抗菌活性测定方法为：采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。 本专利技术还同时提供了利用上述方法制备而得的抗菌活性物。 本专利技术还同时提供了该抗菌活性物的用途：用于抑制或消灭单增李斯特菌。--> 在本专利技术中，含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的制备方法如下：按照标准方法配制0.2M磷酸缓冲液(PH7.0)，然后将其稀释10倍就形成了20mM磷酸缓冲液(pH7.0)，再添加NaCl，直至NaCl的摩尔浓度为0.15M。 在本专利技术的Superdex 75 prep grade柱层析方法中：收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml是指一个检测出具有活性的吸收峰(称为活性峰)，收集其中活性相对最大的3管(3ml)。 经过Super本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗菌活性物的制备方法，其特征是，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＪＵ１５，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：２０１０年４月２日，保藏号：ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１００７４；依次包括以下步骤：１）、制备发酵液：取Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＺＪＵ１５ ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１００７４接种于ＬＢ培养液中，３０℃、２００ｒｐｍ／ｍｉｎ振荡培养１２小时，得种子培养液；将上述种子培养液以５％的体积比浓度接种于ＬＢ培养液中，在３０℃、２００ｒｐｍ／ｍｉｎ振荡培养３０小时，获得发酵液；２）、将发酵液以６０００～８０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，在所得上清液中按照１０．５～１１．５ｇ硫酸铵／１００ｍｌ上清液的投料比加入固体硫酸铵，０℃～４℃下放置１０～１４小时；然后再以１１０００～１４０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０～２０ｍｉｎ，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，所述灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的１／２０；然后再以１１０００～１４０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心取上清，即得抗菌粗提液；３）、将上述抗菌粗提液经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Ｍｉｌｌ Ｑ水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。...
【技术特征摘要】
1.一种抗菌活性物的制备方法，其特征是，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为：Bacillussubtilis ZJU15，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年4月2日，保藏号：CCTCC NO：M2010074；依次包括以下步骤：1)、制备发酵液：取Bacillus subtilis ZJU15 CCTCC NO：M2010074接种于LB培养液中，30℃、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；将上述种子培养液以5％的体积比浓度接种于LB培养液中，在30℃、200rpm/min振荡培养30小时，获得发酵液；2)、将发酵液以6000～8000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照10.5～11.5g硫酸铵/100ml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0℃～4℃下放置10～14小时；然后再以11000～14000rpm/min离心10～20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，所述灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20；然后再以11000～14000rpm/min离心取上清，即得抗菌粗提液；3)、将上述...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫良，林文凭，许松伟，
申请(专利权)人：浙江大学，兰州伟日生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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