ａｐｏ　Ｅ基因和染色体９ｐ２１区段ＳＮＰ检测液相芯片以及特异性引物制造技术

本发明专利技术公开了一种ａｐｏ　Ｅ基因ＳＮＰ检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：ＡＳＰＥ引物对，所述特异性引物是：针对Ｃ６０９Ｔ　ＳＮＰ位点的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１７和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１８、和／或针对Ｔ４７１Ｃ　ＳＮＰ位点的ＳＥＱＩＤ　ＮＯ．１９和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２０；所述ｔａｇ序列选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１～ＳＥＱＩＤ　ＮＯ．１６；分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的、具有不同颜色编码的微球，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３３～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４８中的序列；扩增引物。本发明专利技术还公开了一种ａｐｏ　Ｅ基因和染色体９ｐ２１区段ＳＮＰ检测液相芯片。本发明专利技术所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达１００％。所制备的ａｐｏ　Ｅ和染色体９ｐ２１区段ＳＮＰ检测液相芯片具有非常好的信号－噪声比。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种apo E基因和染色体9p21区段SNP位点检测液相芯片以及特异性引物。 
技术介绍
载脂蛋白E(Apolipoprotein E，apo E)是血浆中重要的载脂蛋白之一。Apo E主要在肝脏合成、分泌和代谢过程中参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血小板聚集、免疫调节等作用。人apo E的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q132)上，基因全长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，其cDNA长为1.163kb。apo E蛋白前体由317个氨基酸组成，含有18个氨基酸信号肽，成熟的Apo E蛋白由299个氨基酸组成。Apo E基因有三个等位基因，即ε2、ε3和ε4，共构成6种不同的基因型：3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和三种杂合型(ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4)。其基因发生频率因不同的种族和地区存在差异，在一般人群中，ε2约占8％，ε3约占78％，ε4占14％。由于编码apo E肽链上第112位和158位氨基酸相对应核苷酸的多态性差异，三种不同的等位基因转录、翻译成三种不同的蛋白异构体，即apo Eε3肽链的第112和158位上的氨基酸分别为半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)，而apo Eε2是在第158位上的Arg被Cys取代，apo Eε4则在第112位上的Cys被Arg所取代。研究发现，不同基因型人群的心血管疾病风险依ε2＜ε3＜ε4次序增大，ε2/ε2的携带者倾向于发生III型的高血脂，ε4等位基因与血浆中胆固醇水平的上升以及由此引致的冠心病风险的提高相关，apo E基因型在预测心脏病相关的环境因素、斯他汀治疗、饮食治疗等对患者的治疗效果中起着重要作用。 WTCCC于2007年对1926例患有冠心病/心肌梗塞或有严重家族史者和2938名对照受试者的全基因组关联研究结果显示：与冠心病相关性最大的多态性位点rs1333049(G＞C)位于9p21区域(P＝1.80×10-14)。该研究结果于2008年经在东亚人群中得到验证。2009于中国人群中得到证实。PROVEIT-TIMI 22研究同样证实：rs1333049C等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多。同时，与冠心病相关的多态性位点还有A22086055G(rs10757274)、A22114477G(rs10757278)、A22105026G(rs2383206)、A22105959G(rs2383207)和A22088619G(rs2891168)，此5个位点均与rs1333049(G22115503C)完全连锁。 目前国内外关于心血管疾病风险的检测日渐增多，已有检测apo E基因多态性的产品上市，如 Celera公司、上海主健生物工程有限公司的检测产品，目前的产品一般基于PCR技术的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。而染色体9p21区段SNP位点，目前国内外几乎没有相关的检测产品。--> 
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供apo E基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测检测apo E基因两种常见基因型C609T(rs7412)和T471C(rs429358)的野生型和突变型。 实现上述目的的技术方案如下： 一种apo E基因SNP检测液相芯片，主要包括有： (A)分别针对apo E基因的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对C609T SNP的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、和/或针对T471C SNP的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16； (B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.33～SEQ ID NO.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列； (C)用于扩增具有C609T和/或T471C SNP位点的apo E基因目标序列的扩增引物。 优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50。 优选地，所述ASPE引物对为针对apo E基因C609T SNP的由SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.17组成的序列、由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.18组成的序列，和/或针对apo E基因T471C的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.20组成的序列。 本专利技术的另一目的是提供对apo E和染色体9p21区段SNP同步检测的液相芯片。该液相芯片可用于检测apo E基因两种常见基因型C609T(rs7412)和T471C(rs429358)的野生型和突变型、以及染色体区段9p21的G22115503C(rs1333049)、A22086055G(rs10757274)、A22114477G(rs10757278)、A22105026G(rs2383206)、A22105959G(rs2383207)和A22088619G(rs2891168)突变的野生型和突变型。 实现上述目的的技术方案如下： 一种apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，主要包括有： (A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.16； 所述特异性引物是：针对apo E基因C609TSNP的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、和/或针对apo E基因T471C的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及 针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、A22086055G SNP的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、A22114477G SNP的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、A22105026G SNP的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、A22105959G SNP的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、和/或A22088619G SNP的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32； (B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.33～SEQ ID NO.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；--> (本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ａｐｏ　Ｅ基因ＳＮＰ检测液相芯片，其特征是，主要包括有：（Ａ）分别针对ａｐｏ　Ｅ基因的ＳＮＰ位点设计的野生型和突变型的ＡＳＰＥ引物对，每条ＡＳＰＥ引物由５’端的ｔａｇ序列和３’端针对ＳＮＰ位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对Ｃ６０９ＴＳＮＰ的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１７和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１８、和／或针对Ｔ４７１Ｃ　ＳＮＰ的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１９和ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．２０；所述ｔａｇ序列选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１６；（Ｂ）分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的、具有不同颜色编码的微球，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选自ＳＥＱＩＤ　ＮＯ．３３～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４８中的序列，且所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列能相应地与（Ａ）中所选的ｔａｇ序列互补配对，且所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；（Ｃ）用于扩增具有Ｃ６０９Ｔ和／或Ｔ４７１Ｃ　ＳＮＰ位点的ａｐｏ　Ｅ基因目标序列的扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：(A)分别针对apo E基因的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对C609TSNP的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、和/或针对T471C SNP的SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.16；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.33～SEQ ID NO.48中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有C609T和/或T471C SNP位点的apo E基因目标序列的扩增引物。2.根据权利要求1所述的apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为SEQ IDNO.49～SEQ ID NO.50。3.根据权利要求1所述的apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对apoE基因C609T SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.17组成的序列、及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.18组成的序列；和/或针对apo E基因T471C SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.19组成的序列、及由SEQ IDNO.4和SEQ IDNO.20组成的序列。4.根据权利要求1-3任一项所述的apo E基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。5.一种apo E基因和染色体9p21区段SNP检测的液相芯片，其特征是，主要包括有：(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.16；所述特异性引物是：针对apo E基因C609T SNP位点的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、和/或针对apo E基因T471C SNP位点的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；以及针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、A22086055G SNP的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、A22114477G SNP的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、A22105026G SNP的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、A22105959G SNP的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、和/或A22088619G SNP的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，秦会娟，余刚，曾涛，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81