本发明专利技术涉及一种昆虫无血清培养基，所述无血清培养基包含５～１０ｇ／Ｌ碳水化合物、４０～６０ｇ／Ｌ氨基酸、５０～１００ｇ／Ｌ无机盐、０．０１～０．１ｇ／Ｌ维生素、１２－２０ｇ／Ｌ的酵母提取物以及２０－４０ｍｌ／Ｌ的化学限定脂质混合物，本发明专利技术的培养基较目前的商用无血清培养基具有更低的成本。实验表明，本发明专利技术的培养基与商用无血清培养基可达到相近的细胞密度和蛋白表达产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及无血清培养基。具体而言，本专利技术涉及昆虫细胞无血清培养基。
技术介绍
细胞培养是将细胞在体外进行繁殖和培养，该工作始于20世纪初，现在已经成为生物学和医学研究领域中不可缺少的工具，并发展成为重要的基础科学之一。细胞培养在基础研究和应用生物医学领域如细胞生物学、生理学、药理学和毒理学上的应用日益广泛，减少了试验动物的使用数目，正符合3Rs理论，即对待动物要有人性(refinement),减少实验动物的使用量(reduction)和尽量找到使用动物的替代方法(replacement)的要求。另外，在最近10年里无脊椎动物细胞和组织培养在细胞和分子生物学基础研究中发挥了越来越重要的作用，应用杆状病毒表达载体，昆虫培养细胞作为宿主的真核表达系统已被广泛应用于生产外源蛋白质，特别是成功表达了大量的具有很高医药价值的活性蛋白质之后，备受人们青睐。要让细胞很好地生长和繁殖，必须努力创造合适的条件，最好模拟细胞原来生长的体内环境，包括温度、PH值、渗透压和氧气供应情况。细胞体外培养需要合适的培养瓶或者特定的培养界面，但是细胞培养中最关键的因素是培养基。大多数商业上可获得的培养基的主要问题是需要向培养基提供大量的血清成分(一般5-20% )，由于血清的高价格和有限制的可获得性，这就造成了一个显著的限制因子。此外，在培养基中动物血清或血清白蛋白的使用从生产的观点上看也是有问题的，这是因为血清中未鉴定的蛋白质的存在可使得下游产品纯化的努力复杂化，并且其中污染的动物病毒可造成严重的安全问题。类似的，在这些材料中发现的未鉴定的蛋白质也向较小规模的实验努力中引入了多余的变量。更进一步地，血清本身的质量在每一批都有变化，这就引入了污染的危险，这些危险必须由科学家或生产工程师针对血清的每一变化来研究和解决。目前已经开发出用于培养昆虫细胞的无血清培养基，例如2006年7月4日提交的JP20060185008中所述的无血清培养基。但这些培养基普遍存在的问题是成本过高，如前述培养基中含有多种小分子添加物，一些重组蛋白。再比如，2004年公开的公开号CN1498267A所述培养基含有高浓度维生素和酵母提取物，提高了成本。不利于大规模的昆虫细胞培养。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供低成本的昆虫细胞无血清培养基。该目的可通过下文所述的技术方案实现。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，所述无血清培养基包含5 10g/L碳水化合物、40 60g/L氨基酸、50 100g/L无机盐、0.01 0.lg/L维生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化学限定脂质混合物。在另一实施方式中，本专利技术的无血清培养基不含半胱氨酸。在另一实施方式中，本专利技术的无血清培养基含有0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。在另一实施方式中，本专利技术的无血清培养基中所述的碳水化合物不包含蔗糖。附图说明图1:High Five细胞在SFMB培养基和Express Five培养基中的生长曲线。图2:High Five细胞在SFMB培养基和Express Five培养基中蛋白表达情况的柱形图。专利技术详述士音养基组成大部分昆虫细胞都利用葡萄糖、果糖或麦芽糖作为主要碳源和能源，在多数培养基中，葡萄糖作为碳源能被迅速利用，虽然在杆状病毒感染后昆虫细胞的生长也会消耗部分蔗糖，但它在培养基中所 起主要作用是调节渗透压。本专利技术的培养基中所含碳水化合物含量在8 10g/L，且不含蔗糖，有利于发酵过程中对渗透压的控制。可用于本专利技术的碳水化合物包括，但不限于，2000-3000mg/L的麦芽糖，8000-10000mg/L的无水葡萄糖。不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求，其中有14种是必需氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。Sf9细胞被认为是甘氨酸和半胱氨酸营养缺陷型的。不过最近的文章表明，如果细胞是在上一代的早期(47 53h)继代，sf9细胞可以在无胱氨酸培养基中生长，在这种情况下，细胞会消耗更多的蛋氨酸来合成半胱氨酸。另有研究表明，在铵离子存在的条件下，Sf9细胞和Sf21细胞也可以在无谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的培养基中生长。然而，Mendonqa 等(Laura A.Palomares and Octavio T.Ramirez.Theeffect of dissolved oxygen tension and the utility of oxygen uptake rateininsect cell culture.Cytotechnology.1996, (22) 225-237)指出缺少谷氨酸胺会影响到细胞的生长速度，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。因此，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。然而，本专利技术发现，将培养基中的谷氨酰胺浓度控制在较低浓度，例如0.45-0.6g/L时，也能达到良好的培养效果。本培养基含有40 60g/L氨基酸，且不含有半胱氨酸，同时含有l_2g/L谷氨酰胺，有效降低了成本。可用于本专利技术的氨基酸包括，但不限于，300-500mg/L的天门冬氨酸，200-600mg/L的苏氨酸，100-300mg/L的丝氨酸，200-300mg/L的谷氨酸，100-150mg/L的甘氨酸，400-600mg/L 的丙氨酸，1000-1500mg/L 的纟颜氨酸，300-600mg/L 的蛋氨酸，300-500mg/L 的异亮氨酸，700-1000mg/L的亮氨酸，2500_3000mg/L的苯丙氨酸，1200-1800mg/L的赖氨酸，400-700mg/L 的组氨酸，1200-1800mg/L 的精氨酸，900_1200mg/L 的脯氨酸，1800-3200mg/L的天门冬氨酸，450-600mg/L的谷氨酰胺，180-220mg/L的羟脯氨酸，160-260mg/L的胱氨酸以及300-400mg/L的酪氨酸。维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。本培养基含有0.01 0.lg/L维生素。可用于本专利技术的维生素包括，但不限于 0.001-0.006mg/L 生物素，0.080-0.120mg/L D-泛酸钙，0.160-0.200mg/L 烟酸，0.0040-0.010mg/L 对氨基苯甲酸，0.002-0.010mg/L 盐酸吡哆醇，0.0003-0.0OlOmg/L维生素BI，0.1-0.06mg/L维生素B12，0.2-0.4mg/L核黄素；以及含于10000X浓缩液的200.0-400mg/L 氯化胆碱。在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+/K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+等能促进细胞贴附和增加产量，其中Al3+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制。本培养基含有50 100g/L无机盐。可用于本专利技术的无机盐包括，但不限于，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，所述无血清培养基包含５～１０ｇ／Ｌ碳水化合物、４０～６０ｇ／Ｌ氨基酸、５０～１００ｇ／Ｌ无机盐、０．０１～０．１ｇ／Ｌ维生素、１２－２０ｇ／Ｌ的酵母提取物以及２０－４０ｍｌ／Ｌ的化学限定脂质混合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：滕小诺，徐龙飞，蔡建华，毛晨，
申请(专利权)人：维亚生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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