促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用。本发明专利技术公开的促肝细胞生长素注射液，选用的促肝细胞生长素为从乳猪肝脏中提取分离获得的一种活性蛋白质，该蛋白质由１５种氨基酸组成，氨基酸总量为１３５．２１±１０．２３ｎｍｏｌ／ｍｌ；主要活性组份蛋白质分子量为２．１万道尔顿，占总含量的６０％以上，具有较高的刺激肝细胞ＤＮＡ合成的活性，使肝细胞再生。该注射液可用于慢性肝炎、重症肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治疗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体涉及促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用。
技术介绍
早在七十年代初，人们发现实验性切除大鼠肝脏的2/3或手术切除大部分损伤的人体肝脏后只需7-10天就可使肝脏恢复到原体积大小并自行停止；同时胚胎肝匀浆注入肝损伤鼠体内可明显促进肝细胞再生，因此认为在体内存在某种物质调节细胞的再生。1973早LaBrecque从大鼠再生肝脏中提取一种肝再生促进物质，将70％肝部分切徐后残余的成年大鼠肝细胞制备匀浆并高速离心，从上清液中提取的物质可明显刺激单层培养的正常大鼠肝细胞DNA合成增加，并命名为“肝刺激物质(Hepatic Stimulator Substance，HSS)。Goldberg从大鼠部分肝切除后的残余肝组织提纯的肝再生因子在体内可使肝细胞DNA合成增加3-4倍；Starzl在狗的再生肝中亦发现类似物质。Russell等和盐田邦郎等证明血小板内的肝再生因子也促进肝细胞DNA合成显著；同步和彦等在肝部分切除后48小时的大鼠小肠粘膜的可溶性成份中提取的肝再生因子与肝组织中的肝再生因子不同；谢明等从人胎肝细胞中提取的人胎肝再生因子具有较强的促进鼠肝细胞DNA合成的作用。广州空军医院陈光明等从乳猪肝中提取的“肝细胞生长素(HGF)”应用于临床治疗各种肝炎患者有较好的疗效。因此，到目前已发现一系列物质均能促进肝细胞DNA合成，调节肝细胞再生，其来源不同，有肝源性、血小板源性和肠源性；分子量等理化性质亦不相同，甚至同一来源不同方法的制备的物质也有差别，所以命名有不同，如“肝细胞再生因子”、“肝细胞生长素(HGF)”、“促肝生长素(Hepatopoietin，HPP)”、“肝刺激物质(HepaticStimulator Substance，HSS)”、“DNA合成促进因子(DNA SynthesisPromoter)”，关于这类物质分子量的报导相差较大，坪内博仁等从暴发性肝炎病人血液中经Sephadex G-200分离后测其分子量为230000；Goldberg等从大鼠血浆中分离后其分子量约为38000；LaBrecque从乳鼠肝脏提取的HSS分子量为1-2万；陈光明制备的乳猪HCF分子量为10685，无论其分子量大小，他们都有其生物活性，使肝细胞DNA合成增加。肝脏再生因子的研究在国内外都报道很多，但应用于临床研究的很少，目前，国内广州空军医院研制的“肝细胞生长素HGF”已初步应用于临床治疗各种肝病患者，为低分子量多肽，有一定的治疗效果。病毒性肝炎在我国是常见病、多发病、其死亡率高，目前无理想的治疗药物，严重影响人们的生命健康。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是采用优化的方法从乳猪肝中提取活性高、纯度理想的促肝细胞生长素，提供一种疗效确切的治疗肝病药物。本专利技术公开了一种含促肝细胞生长素注射液，所述的肝细胞生长素为从乳猪肝脏中提取分离获得的一种活性蛋白质，该蛋白质由15种氨基酸组成，氨基酸总量为135.21±10.23nmol/ml；主要活性组份蛋白质分子量为2.1万道尔顿，占总蛋白含量的60％以上，具有较高的刺激肝细胞DNA合成的活性。所述的组成蛋白质的15种氨基酸为Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。本专利技术所述促肝细胞生长素注射液为每毫升含蛋白质15-25μg、pH6.0-8.0的水针或冻干粉针。本专利技术所要解决的另一技术问题是公开上述促肝细胞生长素注射液的制备方法。本专利技术公开的促肝细胞生长素注射液是通过将乳猪肝匀浆、搅拌、加热、过滤、吸附、洗脱、除盐、除菌、分装获得的。该注射液具体通过下述技术方案制得1.匀浆取经洗涤后的乳猪肝先在搅肉机上初步搅碎，再用胶体磨处理，得到乳猪肝的匀浆。2.搅拌把匀浆置于提取罐内，按比例加入提取液，比例为1∶3W/V，同时以慢速搅拌一小时。3.加热以水浴的方式给提取罐加热，至料液温度达到95℃时停止加热，并在此温度点上保持15-20分钟。4.过滤加热完成后，先把料液冷却至室温，然后用过滤的方式进行固液分离，保留滤液。5.提纯5.1.上样把经固液分离得到的滤液以10升/时的流速上样至已经装好、并经平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上样量为柱体积的6倍。5.2.洗脱上样完毕后，分别用A、B洗脱液进行分段洗脱，并收集B液洗脱峰。5.3.除盐用超滤膜超滤器除盐；6.半成品检定用Lowry法测定蛋白质含量，用注射用水调整其含量，使之为15-25μg/ml；用pH计测定pH值，调节pH值为6.0-8.0；控制氯离子浓度小于1.0mmol/L；7.除菌用0.2μ微孔滤器进行除菌过滤。9.分装，即得水针剂或冷冻干燥得冻干粉针，4℃以下保存。本专利技术制备中所述的提取液为pH值7.6，0.02M的磷酸盐缓冲液(PBS)；所述的A洗液是指含氯化钠0.28M的PBS溶液；所述的B洗液是指含氯化钠0.65M的PBS溶液。本专利技术所要解决的再一技术问题是公开上述促肝细胞生长素注射液在制备治疗肝病药物中的应用。本专利技术促肝细胞生长素注射液能促进肝细胞DNA合成，使肝细胞再生，可用于慢性肝炎、重症肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治疗。其治疗剂量为重症肝炎和肝硬化静脉注射，每次4毫升(60μg)，每天两次，30天为一疗程。慢性肝炎静脉注射，每次2毫升(30μg)，每天两次，30-60天为一疗程。本专利技术促肝细胞生长素注射液对热敏感，4℃以下活性可保存一年，室温14天(25℃)活性降低，95℃，30分钟失去活性。注射液在pH6.0-8.0范围内稳定，不失去活性；对胰蛋白酶敏感，对SDS不敏感。注射液的活性测定可采用体内、外3H-TdR掺入法检测，与对照组比较，均有明显生物活性；其放射性计数(cpm)为对照组的1.7倍以上。用本专利技术促肝细胞生长素注射液进行有关毒理、药代、药效和临床试验一、毒理试验1.促肝细胞生长素注射液的局部试验采用实验豚鼠，经肌肉注射，呼吸平稳、心跳频率在正常范围内无异常改变，无过敏反应，局部亦未发红、肿、热现象，无热源反应。2.促肝细胞生长素注射液的急性及长期毒性试验急性毒性试验选用健康小白鼠，肌肉和静脉两种途径给药，分别作一次肌注和一次静注毒性试验，肌肉和静脉用药剂量达到最高允许剂量即750μg/kg体重时，均无动物死亡，动物行为正常，对外界反应灵敏，LD50无法测算。长期毒性试验，分成为高、中、低剂量组进行动物试验，无动物死亡，亦未发现神经系统、心血管系统、呼吸系统等的异常改变。3.促肝细胞生长素注射液的特殊毒性试验为了观察促肝细胞生长素是否致癌变、畸变，利用姊妹染色体交换(SCE)，染色体畸变和细胞转化等试验，分别从染色体和细胞水平检测促肝细胞生长素注射液是否致畸变和致癌变，设三个剂量组及对照组，同时设平行管，观察细胞染色体的变化，无论从SCE细胞数观察和间隔、二着丝粒、多着丝粒，大小环及染色体间交换，与对照组比较均无统计学差异(P＞0.05)。致癌变试验，采用3T3细胞培养，在软琼脂上培养观察，促肝细胞生长素注射液三个剂量组均无细胞克隆形成，阳性对照组细胞克隆的形成为阳性，空白对照组阴性，说明促肝细胞生长素注射液不致癌变，亦不致突、畸变。4.促肝细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促肝细胞生长素注射液，其特征在于其中所述的肝细胞生长素为从乳猪肝脏中提取分离获得的一种活性蛋白质，该蛋白质由１５种氨基酸组成，分子量为２．１万道尔顿，占总蛋白含量的６０％以上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨锦龙，
申请(专利权)人：威海赛洛金药业有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]