本发明专利技术公开了一种储存宫内膜干细胞的方法，依次包括以下步骤：1）准备采集套装和配制培养基；2）经血收集；3）无菌检查；4）宫内膜干细胞分离培养：将步骤2）所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Chang完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*105~1*106/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中进行培养；5）细胞扩增和纯化；6）细胞冻存。采用本发明专利技术的方法能获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞分离培养与保存相关技术，尤其是从经血中分离宫内膜间充质干细胞，宫内膜干细胞株的建立，以及相应的培养和保存技术。
技术介绍
干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生命科学的生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，还在发现新基因、基因功能分析、发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。近几年来，干细胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最权威的美国《kience》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值，引起了全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞， 具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，而且随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。众所周知，子宫内膜细胞系具有很强的自我更新能力。在每个月经周期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经周期的结束而停止。美日中等多国科学家的最新研究显示在随女性经血脱落的子宫内膜组织中，具有相当数量的间充质干细胞(基质干细胞)——宫内膜干细胞，数量为骨髓来源的30倍；这些干细胞活力更强，更强的自我更新和增殖能力(如心肌细胞的培育效率为传统利用骨髓细胞培育的100倍)，分化潜能更接近胚胎干细胞。有研究发现子宫内膜的再生细胞(ERC)不仅具有几乎每M小时复制一次的惊人速率，而且它们产生独特生长因子的速率，比来自于脐带血的干细胞要大上10 万倍。如果把这些干细胞通过科学的方法储存起来，在女性未来的一生中，一旦发生肿瘤等重大疾病或意外严重伤害时，就可立即做自体干细胞的移植，恢复健康，减轻自己及家人的经济负担，减轻社会负担，还有可能实现女性梦寐以求的“青春常在”、“红颜永驻”的美好愿望，拥有高品质的人生。女性的宫内膜干细胞不但可用于本人，还可为她的子女、相关亲属 (如堂表弟妹，甚至父母)等人的临床应用。由于国内所实行的独生子女政策，一旦患血液系统恶性疾病和遗传性疾病，就只能采用异基因干细胞移植，宫内膜干细胞是异基因干细胞移植最丰富最好的资源。一旦储存了宫内膜干细胞，就相当于为其整个家族建立了一个预防和治疗肿瘤及其它相关需干细胞治疗疾病的生命银行。储存的宫内膜干细胞还可供全国和全世界患者选择作干细胞移植用，并逐步替代价格昂贵、难以找到配型相合的骨髓干细胞。全世界等待干细胞移植的患者数以亿计，仅白血病在我国的发病率就达十万分之三、四，即每年新增四万名左右的患者，而累计的白血病患者约有四百万，其中大部分是儿童，他们都急需通过干细胞移植来救治。目前有经血标本的储存方法是获得经血标本后，经过初步分离，去除大部分的红细胞，然后直接添加冻存液冻存。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种。本专利技术针对现有干细胞来源困难或受伦理限制等问题，寻找一种更为高效的来源广泛且不受伦理限制的宫内膜干细胞分离和培养方法。在此基础上，扩增和纯化干细胞，并对所培养的干细胞进行形态和功能鉴定，从而建立具有干细胞特性的新型干细胞株，然后再将优质的干细胞资源储存。本专利技术的优越之处在于女性废弃的月经血来源广泛，干细胞含量丰富，先通过高效的分离方法能够保证被储存的干细胞的质量。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种，依次包括以下步骤1)、准备采集套装和配制培养基采集管1 装有20ml Hank' s平衡盐溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下浓度万古霉素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、头孢氨苄(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、庆大霉素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、两性霉素 B (Amphotericin B) 2 ~ 3 μ g/mL R 300 500 月干i ；采集管2 装有IOml Hank' s平衡盐溶液(HBSS)，并添加150 250单位肝素；配制Chang完全培养基在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha培养基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、16 20mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、1 3mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、1 3mL青霉素或者链霉素 (Penicillin/Streptomycin, Invitrogen公司，或者为青霉素硫酸盐或者链霉素硫酸盐)、 1 :3mL 浓度为 200mM 的 L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、10 20mL 的胎牛血清(ES-FBS，hvitrogen公司)，充分混勻，置4°C冰箱待用；2)、经血收集收集月经开始的第二或第三天的经血；在采集管1内加入15 20ml的经血，在采集管2内加入5 IOml的经血；并于0 4°C的低温下保存，所述保存期彡48h ；3)、无菌检查将采集管2将离心处理后，得上清液；将上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并鉴定；若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；4)、宫内膜干细胞分离培养将步骤幻所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Chang完全培养基中，单个核细胞的接种密度为 1*105 l*106/ml，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中进行培养；5)、细胞扩增和纯化待步骤4)的单个核细胞接种于Chang完全培养基中开始细胞培养的4 5天后， 更换Chang完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3 4天全量换液一次(可根据细胞生长状况而定，全量换液即指换掉全部的Chang完全培养基)；待细胞生长达到80% 90% 融合时，用质量浓度为0. 25%的胰蛋白酶(一般每1 20ml的细胞中使用Iml的所述胰蛋白酶)消化收集细胞，然后按5000-6000个/cm2密度传代接种培养，并记为Pl代；6)、细胞冻存待步骤幻的Pl代细胞铺满容器底部后，用质量百分含量为0. 25%的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1 2*106/ml ；冻存液为在 9体积份的Chang完全培养基中加入1体积份的DMSO(calbiochem公司)制备而得(即为含有10% DMSO的Chang完全培养基)；将上述被冻存液重悬的细胞进行冻存，冻存步骤如下第一步4°C，等待(即温度降至4°C后，进入第二步)；第二步1. O0C /分钟降至-3. O0C (箱体，即为箱体温度)；第三步10. O0C /分钟降至-20. O0C (箱体)；第四步1 · 0°C /分钟降至-40. 0°C 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．储存宫内膜干细胞的方法，其特征是依次包括以下步骤：１）、准备采集套装和配制培养基：采集管１：装有２０ｍｌ Ｈａｎｋ＇ｓ平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素６０～１００ μｇ／ｍＬ、头孢氨苄１５０～３５０ μｇ／ｍＬ、卡那霉素５０～１５０ μｇ／ｍＬ、庆大霉素８０～１６０ μｇ／ｍＬ、两性霉素Ｂ ２～３μｇ／ｍＬ及３００～５００单位肝素；采集管２：装有１０ｍｌ Ｈａｎｋ＇ｓ平衡盐溶液，并添加１５０～２５０单位肝素；配制Ｃｈａｎｇ 完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入６５ｍＬ ＭＥＭ－ａｌｐｈａ 培养基、１６～２０ｍＬ Ｃｈａｎｇ Ｂ基液、１～３ｍＬ Ｃｈａｎｇ Ｃ基液、１～３ｍＬ青霉素或者链霉素、１～３ｍＬ浓度为 ２００ ｍＭ的Ｌ－谷氨酰胺、１０～２０ｍＬ的胎牛血清，充分混匀，置４℃冰箱待用；２）、 经血收集：收集月经开始的第二或第三天的经血；在采集管１内加入１５～２０ｍｌ的经血，在采集管２内加入５～１０ｍｌ的经血；并于０～４℃的低温下保存，所述保存期 ≤４８ｈ；３）、无菌检查： 将采集管２将离心处理后，得上清液；将所述上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并鉴定；若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；４）、宫内膜干细胞分离培养：将步骤２）所得的采集管１内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Ｃｈａｎｇ 完全培养基中，单个核细胞的接种密度为１＊１０５～１＊１０６／ｍｌ，置于３７℃、饱和湿度、体积分数为５％的ＣＯ２培养箱中进行培养；５）、细胞扩增和纯化：待步骤４）的单个核细胞接种于Ｃｈａｎｇ 完全培养基中开始细胞培养的４～５天后，更换Ｃｈａｎｇ 完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每３～４天全量换液一次；待细胞生长达到８０％～９０％融合时，用质量浓度为０．２５％的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按５０００－６０００个／ｃｍ２密度传代接种培养，并记为Ｐ１代；６）、细胞冻存：待步骤５）的Ｐ１代细胞铺满容器底部后，用质量百分含量为０．２５％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为１～２＊１０６／ｍｌ；所述冻存液为：在９体积份的Ｃｈａｎｇ 完全培养基中加入１体积份的ＤＭＳＯ制备而得；将上述被冻存液重悬的细胞进行冻存，冻存步骤如下：第一步 ：４℃，等待；第二步 １．０℃／分钟降至－３．０℃；第三步 １０．０℃／分钟降至－２０．０℃；第四步 １．０℃／分钟降至－４０．０℃；第五步 １０．０℃／分钟降至－９０．０℃；第六步 结束；取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：项春生，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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