副流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种副流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括一步5xRT-PCRBuffer、阳性对照、阴性对照、四对特异性引物和EnzymeMix；本试剂盒副流感病毒1型设计特异性引物是1F：5'-CCGGTAATTTCTCATACCTATG-3'，1R：5'-CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG-3'。本发明专利技术检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；能进行病毒定性分析；检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中的PCR试剂盒，尤其涉及一种副流感病毒一步 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链式反 应)检测试剂盒。
技术介绍
副流感病毒属副黏液病毒科，单链的RNA包膜病毒，它和鼻病毒、冠状病毒、腺病 毒等多种病毒均被认为是引起普通感冒的病原体。副流感病毒有四种血清型1型可引起 严重的喉炎(假膜性喉炎)、气管炎或支气管炎；2型与1型引起病症的临床表现相似，但不 严重，只有在感染2 4岁儿童时，才可发生严重的感染病例；3型是仅次于呼吸道合胞病 毒的婴儿支气管炎和肺炎的病原体，常引起婴幼儿细支气管炎和肺炎，也可导致假膜性喉 炎；4型引起的病症较轻，多引起成人和儿童的上呼吸道感染，通常不引起肺炎。诊断有两种方法可以诊断人类副流感病毒的感染1)通过组织培养分离鉴定在细胞中的病毒或直接检测存在于呼吸道分泌物中 的病毒，使用免疫荧光试验、酶联免疫反应测定等方法。2)适当时间收集的两份血清标本中IgG特异抗体的显著升高或检测单一血清标 本中特异抗体IgM，而得出结论。没有有效的疫苗来预防人类副流感病毒的感染；然而，科研工作者们正在研制人 类副流感病毒1型和3型的疫苗。婴儿从母体那里被动获得的人类副流感病毒1型和2型 的抗体在婴儿生命最初的几个月里起着非常重要的作用，强调了母乳喂养的重要性。必须 严密注意减少和阻止疾病传播的各种控制措施。经常洗手以及不与感染者共用器具可以减 少病毒的传播。隔离那些得了感冒和呼吸道感染，虽然还能力参加托幼机构学校活动的孩 子，对减少人类副流感病毒的传播可能没有什么意义，因为病毒的传播通常都在疾病的早 期。在医院里，应该采取严格的措施来防止人类副流感病毒的传播，如经常性的洗手，穿戴 有防护性的工作衣和手套等避免直接接触的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种副流感病毒一步 RT-PCR检测试剂盒。本专利技术的目的是这样实现的1、副流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒(简称试剂盒)本试剂盒是在对副流感病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出四 对特异性引物，利用PCR技术对流感病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污 染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现 对副流感病毒的检测。具体地说，本试剂盒包括一步5xRT_PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、四对特异性 引物和 Enzyme Mix ；①副流感病毒1型设计特异性引物IF 5 ’ -CCGGTAATTTCTCATACCTATG-3’，IR :5，-CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG-3，；副流感病毒2型设计特异性引物2F 5，-AACAATCTGCTGCAGCATTT-3，，2R 5' -ATGTCAGACAATGGGCAAAT-3，；副流感病毒3型设计特异性引物3F 5 ’ -CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3’，3R 5' -CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3，；副流感病毒4型设计特异性引物4F 5，-CTGAACGGTTGCATTCAGGT-3，，4R 5，-TTGCATCAAGAATGAGTCCT-3，。②阳性对照分别连接有设计副流感病毒1、2、3、4型引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载 体；③阴性对照RNase Free H2O ；④5 X RT-PCR Buffer 配制Tris-HCl250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mMdNTPIOmM 配置混合后于冰箱-20 V保存；⑤ Enzyme Mix 配制Tris · Cl KCl DTT EDTANonidet P-40 Tween 20 甘油 Taq酶 M-MLV 酶配置混合后于冰箱-20 V保存。2、试剂盒的使用方法①病毒核酸的提取A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；B、取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml离心管中；C、将标本(如咽拭子、痰液等)取200 μ 1加入此管中，充分混勻；D、再在每管分别加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振荡30s， 70°C温育 IOmin ；E、加入250 μ 1无水乙醇，充分混勻振荡30s，室温裂解5min ；F、将上述裂解液加入离心柱中，SOOOrpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。滤柱仍 放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；G、滤柱中加入500 μ 1缓冲液1，12000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液；H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加 Λ 500 μ 1缓冲液2，12000rpm,离心lmin,重复步骤⑧一次；I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm,离心3min，后将滤柱放在 370C 15min以干燥滤膜；J、将滤柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase_free H2O,室温静 置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。②一步RT-PCR扩增(每份25ul体系)取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul —步RT-PCR反应液至PCR管中进行PCR扩增。A、一步RT-PCR反应液(mix)的配制20mM 80mM ImM 0. ImM 0. 5% 0. 5% 50% 2. 5U/ul 2. 5U/ul权利要求1. 一种副流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于本试剂盒包括一步hRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、四对特异性引物和EnzymeMix ；①副流感病毒1型设计特异性引物 IF :5’ -CCGGTAATTTCTCATACCTATG-3，， IR :5’ -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG-3’ ； 副流感病毒2型设计特异性引物2F :5’ -AACAATCTGCTGCAGCATTT-3’， 2R :5’ -ATGTCAGACAATGGGCAAAT-3，； 副流感病毒3型设计特异性引物 3F :5’ -CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3’， 3R :5’ -CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3，； 副流感病毒4型设计特异性引物 4F :5’ -CTGAACGGTTGCATTCAGGT-3，， 4R :5’ -TTGCATCAAGAATGAGTCCT-3，。②阳性对照分别连接有设计副流感病毒1、2、3、4型引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体；③阴性对照 RNase Free H2O ；④5 X RT-PCR Buffer 配制Tris-HCl250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mMdNTPIOmM配置混合后于冰箱-20°C保存； ⑤Enzyme Mix配制Tris · Cl20mMKCl80mMDTTImMEDTA0. ImM本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种副流感病毒一步ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括一步５ｘＲＴ－ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、阳性对照、阴性对照、四对特异性引物和Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ；①副流感病毒１型设计特异性引物１Ｆ：５’－ＣＣＧＧＴＡＡＴＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＡＴＧ－３’，１Ｒ：５’－ＣＣＴＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＧ－３’；副流感病毒２型设计特异性引物２Ｆ：５’－ＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴ－３’，２Ｒ：５’－ＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＡＴ－３’；副流感病毒３型设计特异性引物３Ｆ：５’－ＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＧ－３’，３Ｒ：５’－ＣＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴ－３’；副流感病毒４型设计特异性引物４Ｆ：５’－ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＧＴ－３’，４Ｒ：５’－ＴＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＴＣＣＴ－３’。②阳性对照分别连接有设计副流感病毒１、２、３、４型引物的基因保守序列的ｐＧＢＫＴ－７克隆载体；③阴性对照ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏ；④５×ＲＴ－ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ配制配置混合后于冰箱－２０℃保存；⑤Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ配制配置混合后于冰箱－２０℃保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建国，刘映乐，艾洪武，刘为勇，石康，熊鹰，程议锋，项荣，汤行春，章琪，胡晓静，王珊，王妍，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83