本发明专利技术对容易受到噬菌体污染的ＷＳＨ－Ｚ０６的宿主菌分别进行紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有ＢＰ－１和ＢＰ－２双重抗性的大肠杆菌宿主菌，随后用编码Ｌ－苯丙氨酸合成酶基因的质粒（ｐＡＰ－Ｂ０３）转化宿主菌，得到抗噬菌体Ｌ－苯丙氨酸生产菌ＷＳＨ－ＢＲ１６５（ｐＡＰ－Ｂ０３）；本发明专利技术将传统紫外诱变育种的优点与分子生物学改造的优点相结合，通过噬菌体淘汰培养的方法，高效率地筛选并构建出一株具有噬菌体ＢＰ－１、ＢＰ－２抗性的Ｌ－苯丙氨酸生产菌。
A dual phage resistance L-phenylalanine producing bacteria and its breeding method
The invention of WSH host bacteria Z06 on susceptible bacteriophage contamination were treated by ultraviolet radiation and phage were screened out of training, with BP - 1 and BP - 2 double resistance of host Escherichia coli, followed by plasmid encoding L - phenylalanine synthase gene (pAP B03) into the host bacteria, get antiphage L - phenylalanine producing strain WSH - BR165 (pAP - B03); the advantages of molecular biology and the transformation of traditional ultraviolet mutation breeding combined with cultured methods eliminated by phage, efficient screening and construct a strain of phage BP1, BP2 resistant L-phenylalanine producing strain.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有双重噬菌体抗性的微生物及其选育方法，属于生物工程技 术领域。
技术介绍
噬菌体污染是影响氨基酸发酵生产的关键因素之一。如果在生产中受到噬菌体 的污染，会影响生产率，从而影响企业效益。其来源很多，在相对较长的发酵周期中， 无论哪个环节发生污染，都会对整个过程造成影响。多年来，企业在噬菌体在生产过程 对噬菌体的防治上积累了大量的经验，但选育抗噬菌体的生产菌株才是最有效的方法。本实验室前期开发了 一株L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42 (CCTCC M 2010008)， 该菌株具有噬菌体BP-1(CCTCC M 2010054)抗性，但在实际生产中发现该菌种又受到了 噬菌体 BP_2(CCTCC M 2010055)的污染。利用诱变手段筛选抗噬菌体的菌株是选育抗性菌株的方法之一。由于现在所知 的诱变方法已有很多，其对机理方面的要求也不高，人们在对诱变方法的选用上已有了 很多的经验。但往往用诱变手段选育菌种具有一定的盲目性，是一件耗时耗力的工作。 在筛选抗噬菌体抗性的大肠杆菌方面，本专利技术提出在诱变后培养阶段利用噬菌体淘汰培 养的方法，就如何快速有效的获得目的菌株而言提供了一条新的途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一株重组大肠杆菌WSH-BR165 (pAP-B03)，该菌株具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体BP-I (CCTCC M 2010054,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中国武汉，武 汉大学，分类学命名为大肠杆菌噬菌体QBacteiiopMge))和BP-2的(CCTCC M 2010055，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中国 武汉，武汉大学，分类学命名为大肠杆菌噬菌体(^ac—opMge))双重抗性；含有 重组质粒，质粒上携带L-苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏时间2010年1月18日，地址中国武汉，武汉大学，分类学命名为大肠杆菌 {Escherichia coli)，保藏编号为 CCTCC M 2010013。所述噬菌体BP-I来源于本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH_ZH06(含 重组质粒pAP_B03，CCTCC M 2010009)受到噬菌体污染的裂解液，噬菌体BP-I已 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2010年3月15日，保藏编号为CCTCCM 2010054 ；噬菌体BP-2来源于本实验室开发的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR42 (含重组 质粒pAP_B03，CCTCCM 2010008)受到噬菌体污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌体 BP-I的抗性，但不具有噬菌体BP-2的抗性，噬菌体BP-2已保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏时间2010年3月15日，保藏编号为CCTCC M 2010055。所述重组质粒为pAP_B03，其上携带L-苯丙氨酸合成的关键酶CM/PDT和 DS的基因PheAfbInaroF,其中pheA^基因来源于E.coli K12的突变株，aroF来源于 E.coli K12 (Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt. HaiyanZhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)。本专利技术所要解决的另外一个技术问题是提供了一种紫外线诱变育种、噬菌体淘 汰培养以及分子生物学改造相结合的L-苯丙氨酸生产菌的选育方法。为解决上述技术问题，对容易受到噬菌体污染的WSH-Z06的宿主菌 (EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, XianyanLiao, Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)分另ll进 亍 紫外线诱变处理、噬菌体淘汰培养，筛选到一株具有BP-I和ΒΡ-2双重抗性的大肠杆菌 宿主菌，随后用编码L-苯丙氨酸合成酶基因的质粒(ρΑΡ-Β03)转化上述大肠杆菌宿主 菌，得到具有双重噬菌体抗性的L-苯丙氨酸生产菌WSH-BR165 (ρΑΡ-Β03)。所述紫外线诱变处理，具体方法为培养WSH-Z06的宿主菌，离心、洗涤菌体后 在紫外照射10-60s进行诱变处理。所述噬菌体淘汰培养，具体方法为在紫外线诱变处理后，红灯下在培养皿中分 别吸取一定含量菌液于装有30mL LB培养基和各ImL效价为liTpfu/mL的噬菌体BP-I 和BP-2裂解液的三角瓶中培养6h，使得诱变后不具有噬菌体抗性的菌被淘汰，具有双重 噬菌体抗性的菌得到富集。所述噬菌体抗性筛选，具体方法为离心、收集、培养诱变后的菌体，挑取形 态、大小、颜色各不相同的菌落逐一涂布单层平板，然后在平板的4个象限处分别各滴 加5 μ L噬菌体BP-I和ΒΡ-2的裂解液，做好标记，培养24h后，挑取在4处滴加噬菌体 的地方均没有出现噬菌斑的菌株。所述噬菌体裂解液BP-1，取样于受噬菌体污染的WSH-Z06(pAP_B03)发酵 液，经过分离、培养后获得，具体方法为发酵液离心后的上清液经0.22μιη微孔滤 膜过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的 WSH-Z06(pAP_B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法挑 取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37°C振荡 培养 16-24h。所述噬菌体裂解液BP-2，取样于受噬菌体污染的WSH-BR42(pAP_B03)发酵 液，经过分离、培养后获得，具体方法为发酵液离心后的上清液经0.22 μ m微孔滤膜 过滤除菌，取出一定上清液放入装有肉膏蛋白胨培养基的试管中，同时加入一定量的 WSH-BR42 (pAP-B03)菌悬液，培养一段时间，待长出单个噬菌斑后，用接种针穿刺法 挑取形态、大小不一的单个空斑分别接入含有敏感菌WSH-Z06的液体培养基中，37°C振 荡培养16-24h。所述噬菌体抗性检测培养基，采用肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，琼脂 2%。所述抗噬菌体L-苯丙氨酸生产菌，其优选培养基组成为(1)种子培养基使用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固体培养基加2%的琼脂。(2)发酵培养基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸钙12.5，七水合硫酸镁3.0，二水合氯化钙 0.015，磷酸二氢钾3.0，氯化钠1.0，硫酸铵5.0，七水合硫酸亚铁0.075，柠檬酸钠1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 ·本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｌ－苯丙氨酸生产菌，其特征在于：该菌株具有对重组大肠杆菌易感染噬菌体ＢＰ－１（ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１００５４）和ＢＰ－２的（ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１００５５）双重抗性；含有重组质粒，质粒上携带Ｌ－苯丙氨酸合成酶基因，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间２０１０年１月１８日，保藏编号为ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１００１３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，王静，周海岩，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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