抑制肿瘤生长的siRNA及其寡聚核酸组合与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制肿瘤生长的siRNA及其寡聚核酸组合与应用。本发明专利技术所述的寡聚核酸是如下1)或2)的双链RNA：1)序列表中序列1和序列2组成的寡聚核酸siPTN；2)所述1)的寡聚核酸siPTN与miR-34a组成的双寡聚核酸，所述miR-34a是序列表中序列3和序列4组成的寡聚核酸。将肿瘤细胞接种于裸鼠，形成肿瘤后用所述寡聚核酸治疗的实验证明所述寡聚核酸组合能在体内有效抑制肿瘤的生长。作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。

SiRNA and oligonucleotide nucleic acid combination for inhibiting tumor growth and application thereof

The invention discloses a siRNA and oligonucleotide nucleic acid combination for inhibiting tumor growth and application thereof. The oligonucleotides is as follows: 1) 2) or double stranded RNA:1) sequence 1 in the sequence table and the sequence consisting of 2 oligonucleotides siPTN; 2) the 1) double oligo oligomeric nucleic acid siPTN and miR-34a consisting of poly nucleic acid, wherein miR-34a is a sequence 3 in a sequence table 4 and the sequence consisting of oligonucleotides. After the tumor cells were inoculated in nude mice to form a tumor, experiments with the oligonucleotide treatment showed that the oligonucleotide combination inhibited tumor growth effectively in vivo. As antitumor agents of new small nucleic acids, the chemically synthesized and modified oligonucleotides are not easily degraded and have a longer effect half-life. They can be used in vitro experiments and can be used in vivo.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抑制肿瘤生长的SiRNA及其寡聚核酸组合以及相关的应用。
技术介绍
Pleiotrophin(PTN)(多效素)是一种分泌性生长因子，它具有多效性功能，在细 胞的增值、分化、和血管形成中起重要的作用。研究发现PTN在脑肿瘤，乳腺癌，胰腺癌，结 肠癌，胃癌，肺癌，睾丸癌，黑色素瘤等多种肿瘤组织均出现高表达而在正常的组织中很少 表达。因此推测选择PTN作为肿瘤治疗的靶点既有肿瘤的特异性，又有肿瘤的普适性的特 点。由于PTN既能刺激细胞生长，又能加速血管生成，用siRNA沉默PTN的表达，可能能够 有效地抑制肿瘤的生长和转移。根据肿瘤发生发展的不同机理，将PTN-siRNA和其它抗肿 瘤的小干扰RNA(siRNA)以及微小核酸(miRNA)组成不同的配方，将比单一的PTN-siRNA更 能有效地治疗肿瘤性疾病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种寡聚核酸在制备抑制肿瘤生长的试剂或在抑制PTN 表达中的应用；所述寡聚核酸是如下1)或幻的双链RNA 1)序列表中序列1和序列2组成的寡聚核酸SiPTN ；2)所述1)的寡聚核酸SiPTN与mil^Ma组成的双寡聚核酸，所述mil^Ma是序列 表中序列3和序列4组成的寡聚核酸。进一步讲，上述2)的双寡聚核酸中，所述1)的寡聚核酸SiPTN与mil^Ma的质量 比是(0.5-2) (0.5-2)，优选是 1 1。在实际应用中，上述寡聚核酸可以是经过如下1)或幻修饰得到的寡聚核酸1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键 的氧用硫取代；2)对所述寡聚核酸的核糖的2’_0H的修饰，优选将所述2’_0H用甲氧基或氟取代 或者对所述2’ -OH进行脱氧修饰。上述序列表中序列1、3、5从左至右方向为5’ _3’，序列表中序列2、4、6从左至右 方向为3’ -5’。上述肿瘤可以是肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌或肺癌。上述试剂中可包含上述寡聚核酸分子中的至少一种以及至少一种药学上可接受 的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本专利技术药物组合物中的双链RNA分子 相容。在一个优选实施例中，所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙烯亚 胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，TF-PEI(转铁蛋白聚乙烯亚胺)脂质体，转铁蛋白，叶 酸等。上述寡聚核酸为化学合成，可以进行2'氟代O' _F)、2'甲氧基O' -(Me)At 代(PQ和2'脱氧O' -deoxy)等化学修饰。用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染鼻咽癌细胞株CNE、肠癌细胞株 HCT116、乳腺癌细胞株MCF7、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株H印G2等肿瘤细胞的实验结果 表明所述1)或幻寡聚核酸能有效抑制上述肿瘤细胞的增殖，具体如图6所示，siPTN单独 处理组与对照组(PBQ平均瘤重轻38. 2%，混合治疗组的平均瘤重PBS组轻51. 89%。将肿瘤细胞接种于裸鼠，形成肿瘤后用所述寡聚核酸治疗的实验证明所述寡聚核 酸组合能在体内有效抑制肿瘤的生长。作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解， 有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。附图说明图1为MTT法检测siPTN抑制肿瘤细胞增殖的柱形图。图2为QRT-PCR检测siPTN抑制肿瘤细胞PTN的表达。图3为RT-PCR检测siPTN抑制肿瘤细胞的PTN表达，2' _F_siPTN泳道1_4分别 为转染siPTN，转染2' -F-siPTN，未转染的细胞，转染随机序列的阴性对照(NC)。图4为2' -F-siPTN及其寡聚核酸治疗肠癌移植瘤5次以后的裸鼠肿瘤效果图。图5为2' -F-siPTN及其寡聚核酸组合治疗肠癌6次以后的瘤体积折线图。图6为2' -F-siPTN及其寡聚核酸组合加治疗肠癌6次以后的瘤重柱形图。图7为2' -F-siPTN及其寡聚核酸组合治疗肠癌6次以后肿瘤效果图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、寡聚核酸的制备本专利技术中所述寡聚核酸PTN-s iRNA序列正义链 为5 ‘ -GCCCAAACCUCAAGCAGAATT-3‘ (SEQ ID No. 1)；反义链为 3，-TTCGGGUUUGGA⑶UC⑶CUU-5，(SEQ ID No. 2)；本专利技术中 miR_34a 正义链为 5，-UGGCA⑶⑶CUUAGCUG⑶UGU-3，(SEQ ID No. 3)；反义链为 3，-UUACC⑶CACAGA AUCGACCAA-5’ (SEQ ID No. 4)；本专利技术中所述随机序列作为阴性对照(NC)，NC的 正义链序列为5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ (SEQ ID No. 5)，反义链序列为 3，-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，(SEQ ID No. 6)。所述寡聚核酸和 NC 序列中的 A、G、C、U 表 示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示 胸腺嘧啶脱氧核苷酸。所述寡聚核酸和NC委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成并进 行如下任意一种化学修饰2'甲氧基O' -OMe),2'氟代O' -F)、硫代和2'-脱氧 (2’ -deoxy)，然后经冻干处理得到寡聚核酸粉末，用于实施例2_4中的实验。其中miR_;Ma经2'氟代修饰后命名为2' -F-miR-IMa ;PTN_siRNA经2‘甲氧基 修饰后命名为2' -F-siPTN ;NC经2'氟代修饰后命名为2' -F-NC。上述合成方法源自一篇1995年公开的文献Wincott F, DiRenzo A, Shaffer C, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S and UsmanN. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995，23 :2677_84。整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核 糖核酸的合成；( 脱保护；C3)纯化分离；(4)脱盐退火无菌消毒。(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自动DNA/RNA 合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定 合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的 5’-0_对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第η次 (19 ^n ^ 2)循环中，在第η-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成 全部核酸序列的合成。(2)脱保护将连接有RNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙 胺(体积比为1 3)，然后密封，置于55-70°C温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA 的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。 然后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．寡聚核酸在制备抑制肿瘤生长的试剂或在抑制ＰＴＮ表达的试剂中的应用；所述寡聚核酸是如下１）或２）的双链ＲＮＡ：１）序列表中序列１和序列２组成的寡聚核酸；２）所述１）的寡聚核酸与ｍｉＲ－３４ａ组成的双寡聚核酸，所述ｍｉＲ－３４ａ是序列表中序列３和序列４组成的寡聚核酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李建娜，张雅鸥，谢伟东，何杰，张佩琢，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，上海吉玛制药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94