一种用于耐药结核血清学诊断的Rv1793重组蛋白制造技术

本发明专利技术属于结核病诊断技术领域，具体为一种用于多耐药结核杆菌血清学诊断的重组蛋白。该重组蛋白为Rv1793重组蛋白，由如下步骤获得：将Rv1793插入到pET28aEcoRI和HindIII酶切位点之间形成重组质粒，然后转化到E.coliBL21中形成重组E.coli，表达该蛋白。这种新的重组蛋白用于耐药血清学诊断的敏感性可以达到75%，远远大于对照CFP-10重组蛋白的耐药诊断率53.3%。Rv1793重组蛋白将成为一种有效的应用于耐药结核血清学诊断的生物标志物。

Rv1793 recombinant protein for serological diagnosis of drug-resistant tuberculosis

The invention belongs to the technical field of tuberculosis diagnosis, in particular to a recombinant protein used for serological diagnosis of multi drug resistant tubercle bacillus. The recombinant protein Rv1793 recombinant protein obtained by the following steps: the insertion of Rv1793 into pET28aEcoRI and HindIII restriction sites between the recombinant plasmid, then transformed into recombinant E.coli to form E.coliBL21, the expression of the protein. The sensitivity of this new recombinant protein for resistance to serological diagnosis could reach 75%, much higher than that of control CFP-10, and the diagnostic rate of recombinant protein was 53.3%. Rv1793 recombinant protein will be an effective biomarker for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于结核病血清学诊断
，具体涉及一种用于多耐药结核杆菌的血清学诊断的重组蛋白。
技术介绍
结核分枝杆菌对临床常用的抗结核一线药物包括异烟胼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin, RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)、链霉素(str印tomycin, SM)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)等均存在耐药现象，甚至是对多种药物同时产生耐药的情况，即出现MDR-TB。MDR-TB是指结核病患者排出的结核分枝杆菌对至少包括INH和RFP在内的 2种或2种以上药物产生耐药。据WHO估计全球有5000万人感染耐药结核杆菌，其中中国最多，占到11%，耐药甚至耐多药的结核杆菌的爆发流行已成为世界范围内的严重的公共卫生问题。由于对耐药结核杆菌没有有效的治疗药物，在治疗中只能选用毒副作用更大的二线药物，这不仅极大地增加了治疗的成本和时间，而且死亡率也很高。因此对于耐药结核病的早期诊断和早期治疗成为控制耐药结核病的重要手段。目前临床正在使用和研究的耐药结核杆菌的检测方法大体可分为表型检测和基因检测两大类。表型检测是基于结核杆菌培养的方法，该方法是结核杆菌诊断的金标准，但耗时长，如加上药敏试验，从病人就诊到得到药敏结果约需要10周的时间，远不能满足临床诊治的需要。表型检测另一种是BACTECT 方法，这一方法虽然较快但由于设备昂贵，难以在临床推广。基因检测如DNA序列测定、基因芯片技术等指的是测定耐药相关基因突变位点的方法，但是由于耐药位点很多，而且很多耐药相关基因未知，因此不能检测所有的突变类型。另外，基因检测方法对实验技术要求高，影响因素也很多。因此，这些方法目前不足以用于临床标本的直接检测。结核分枝杆菌的血清学诊断具有简便、快速、价格便宜、标本容易获得、不需要特殊的大型检测设备等优点。目前在研的几种结核分枝杆菌诊断抗原主要包括结核菌素、 CFPlO、38 kD 蛋白、Ag85、ESAT-6、MPT64、Mtb8.4、LAM、TB4。但每一种抗原只能检出一部分的感染者，并且对于耐药性结核迄今为止仍未找到特异性高、敏感性强的诊断抗原。本专利技术找到了特异性和敏感性较高的耐药结核血清学诊断的生物标志物Rvl793蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于耐药结核血清学诊断的重组蛋白，并提供该重组蛋白在耐药结核血清学诊断中的应用。本专利技术提供的用于耐药结核血清学诊断的重组蛋白，是一种Rvl793重组蛋白，该重组蛋白由如下步骤获得将Rvl793插入到pET28a EcoRl和历'/^III酶切位点之间形成重组质粒，然后转化到五coli BL21 (DE!3)中形成重组五cWi，表达该蛋白。该重组蛋白可用作耐药结核血清学诊断的生物标志物。本专利技术还涉及一种重组质粒，该重组质粒中含有Rvl793蛋白的编码序列。本专利技术还涉及所述重组蛋白的制备方法，具体包括以下步骤(1)扩增AW7幻基因；(2)用和历ii/III酶双酶切AV77幻基因序列，并与原核载体pET28a相连，形成重组质粒；(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达，即获得Rvl793重组蛋白。本专利技术还提供该重组蛋白作为生物标志物用于耐药结核血清学诊断的具体方法， 其具体步骤为(1)包被=IOOyL /孔浓度为Syg/mL的RV1793重组蛋白4°包被过夜。(2)洗板PBST 300 μ L / 孔，3min，洗 3 次，拍干。(3)封闭1% BSA 的 PBS, 300 μ L / 孔，37°C 孵育 2 小时。(4)洗板PBST 300 μ L / 孔，3min，洗 3 次，拍干。(5)加入1:100稀释的待测血清，IOOyL /孔，37°C孵育1小时。(6)洗板PBST 300 μ L / 孔，5min，洗 5 次，拍干。(7)加酶标二抗于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(稀释倍数按照试剂推荐)300ul。37°C孵育1小时，洗涤同(6)。(8)加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物显色液100μ L，37°C 5mirio(9)加终止液于各反应孔中加入50 μ L终止液。(10)在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。本专利技术提供的这种新的重组蛋白用于耐药血清学诊断的敏感性可以达到75%，远远大于对照CFP-10重组蛋白的耐药诊断率53. 3%。因此，Rvl793重组蛋白将成为一种有效的新的应用于耐药结核血清学诊断的生物标志物。附图说明图1为Rv 1793重组蛋白HPLC图。图2为Rv 1793重组蛋白纯化后SDS-PAGE图片。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员对本专利技术各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。将重组蛋白克隆表达纯化后将能得到如附图2所示的纯化Rvl793重组蛋白，然后按照如下面实施例所示的步骤进行待测病人血清学鉴定，这样可以检测出75%的耐药血清 (见表一)。实施例将有活性的浓度为Syg/mL的重组Rvl793蛋白，IOOyL /孔包被4°过夜； 300 μ L / 孔 PBST，每次;3min，洗 3 次，拍干；用 BSA 的 PBS，300yL / 孔，37°C 孵育 2小时封闭；300 μ L /孔PBST，每次3min，洗3次，拍干；加入1 100稀释的健康血清和待测的病人血清，IOOyL /孔，37°C孵育Ih ;300 μ L /孔PBST，每次5min，洗5次，拍干；于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体300ul，37°C孵育Ih ;300μ /孔PBST，每次5min， 洗5次，拍干；于各反应孔中加入TMB显色液100 μ L，37°C 5 min ；各反应孔中加入50 μ L终止液，在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。然后以健康对照血清的平均值加上2倍的标准偏差为准，大于此值的为阳性，反之为阴性。此结果可以检测出75% 的耐药血清。 表一重组Rvl793蛋白诊断耐药病人的敏感性和特异性权利要求1.一种用于结核耐药血清学诊断的重组蛋白，其特征在于为RV1793重组蛋白，该重组蛋白由如下步骤获得将Rvl793插入到pET28a EcoRl和历'/^III酶切位点之间形成重组质粒，然后转化到五coli BL21中形成重组五cWi，表达该蛋白。2.一种重组质粒，其特征在于，该质粒中含有Rvl793蛋白的编码序列。3.如权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤为(1)扩增AW7幻基因；(2)用和历ii/III酶双酶切AV77幻基因序列，并与原核载体pET28a相连，形成重组质粒；(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达。4.一种如权利要求1所述的重组蛋白作为耐药结核血清学诊断生物标志物的应用。全文摘要本专利技术属于结核病诊断
，具体为一种用于多耐药结核杆菌血清学诊断的重组蛋白。该重组蛋白为Rv1793重组蛋白，由如下步骤获得将Rv1793插入到pET28aEcoRI和HindIII酶切位点之间形成重组质粒，然后转化到E.co本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于结核耐药血清学诊断的重组蛋白，其特征在于为Ｒｖ１７９３重组蛋白，该重组蛋白由如下步骤获得：将Ｒｖ１７９３插入到ｐＥＴ２８ａ　ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点之间形成重组质粒，然后转化到Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　中形成重组Ｅ．ｃｏｌｉ，表达该蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪海，彭超，张鹭，刘丹，徐文玺，何磊，王文婕，郝科威，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31