一种辅助鉴定翦股颖属植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种辅助鉴定翦股颖属植物的方法。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：以待测植物的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物，待测植物为翦股颖属植物。本发明专利技术通过对不同草坪草种属品种抗逆性基因AsEXP1的克隆，分析其序列位点差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选得到了翦股颖属草坪草特异性分子标记。本发明专利技术提供的特异引物对(cAs3F/cAs3R)可以辅助鉴定翦股颖属品种，可以用于草坪草种属品种的鉴定、亲缘关系分析及进化路径分析等，并为草坪草的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。

An auxiliary identification method of bentgrass plants of the genus

The invention discloses a method for identification of auxiliary bentgrass plants of the genus. The method of the invention comprises the following steps: genomic DNA for measuring plants as template, primer sequences shown in Table 1 and shown in sequence 2 DNA DNA amplification of PCR, if PCR products were tested for bentgrass plants of the genus plants. The present invention by cloning AsEXP1 gene of different resistance of varieties of turf grass species, analysis of the sequence differences, understand the genes in different species variation among species, and by sequence analysis, screened Agrostis grass specific molecular markers. Specific primer of the invention provides (cAs3F/cAs3R) can help the identification of bentgrass species, can be used for turfgrass species identification, phylogenetic analysis and evolutionary path analysis, and provide theoretical basis and technical support for turfgrass molecular marker assisted breeding and genetic improvement.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅助鉴定剪股颖属植物的方法。
技术介绍
草坪草是一种城市绿化植物，也广泛应用于体育场地、高速公路及河岸提坡防 护、消除污染等方面，体现了巨大的生态效益。草坪草种类繁多，生长环境迥异，按气候条 件分类可分为暖季型草坪草和冷季型草坪草，按不同科属分类可分为禾本科虎尾草亚科 Poaceae (Gramineae) (7 个属)、黍亚科 Panicoideae (6 个属)、早熟禾亚科 Pooideae (12 个 属)，以及莎草科Cyeraceae O个属)和豆科及旋花科的一些品种等。剪股颖属(Agrostis L)植物为禾本科早熟禾亚科多年生草本，是世界上最重要的冷季型草坪植物之一，喜冷凉 湿润气候，耐寒能力强，绿期长，观赏效果好，广泛用于庭院、公园等地的观赏性草坪，其优 良品种用于高尔夫球场果岭区绿化。在草坪草杂交育种工作中，为了提高杂交育种的效率和成功率，需要选用亲缘关 系较近且品质优良的两个品种进行杂交。因此杂交育种的前期工作，就是要明确每个品种 的亲缘关联、隶属关系等。长期以来，生物学家主要通过形态学和解剖学证据划分不同的物 种，但这些表型特征种类有限，且容易受到环境因素和发育阶段的影响，加之自然选择导致 的普遍趋同效应和平行进化因素等，使得物种系统发育关系的判断困难重重。草坪草对环 境的忍受力较强，可以在各种环境下生存，长期自然或人工选择的结果，使得自然界中产生 了各种各样的草坪草类型，包括各种各样的生态类型、丰富多彩的野生资源等。如果不能高 效准确的鉴别草坪草不同的基因型，确认它们之间的亲缘关系，杂交育种的亲本选择就存 在一定的盲目性，多样化草坪草基因资源的利用就会受到极大的限制。基因作为遗传信息的载体，保留了很多进化的痕迹，同一基因在不同物种中的序 列差异可以作为分类鉴定的分子标记，具有信息量大、能够稳定遗传等优点。2002年，Frits Goedegebuur利用简并引物于来自22个不同种属的真菌中分离了糖基水解酶12家族的15 个新成员，并结合SwissProt等蛋白质数据库中的氨基酸数据，分析了所有已知糖基水解 酶12家族的系统发育关系，发现该家族分为四个亚家族，同一亚家族的家族成员分布在同 一属中或近似属中。1990年，Woese利用16S rRNA基因构建的系统进化树，在分子水平上 将整个生物界分为三个域古细菌、真细菌和真核生物，有力的支持了三界学说，得到大多 数学者的赞同。2003年，刘占林等使用5S rRNA基因序列考察裸子植物的系统发育关系， 发现不同裸子植物样本间5S rRNA基因序列平均相似度高达94.4%，而包括小麦、水稻和 玉米在内的六种被子植物的5S rRNA基因序列相似度为97. 6%，裸子植物与被子植物之间 为88. 1%，作为原始被子植物的木兰属植物与裸子植物有90. 8%的相似性，由此推测出裸 子植物和被子植物的进化路径。杨玲玲(2000年)在研究拟诺卡氏菌系统发育关系时，分 析了拟诺卡氏菌属内不同种的看家基因gyrB和16SrRNA基因序列，并构建系统进化树，发 现gyrB基因的建树效果要优于16SrRNA基因，二者所建进化树拓扑结构相似，但gyrB基因 树的分歧度和各分支的自展值更高，说明利用编码蛋白质基因构建物种系统进化树具有较高的分辨率，效果更好。2009年，刘念等人研究南洋杉科系统发育关系时采用了多基因联合 建树的方法，利用核18S rRNA和^S rRNA、叶绿体16S rRNA、rbcL、matK和rps4以及线粒 体coxl和atpl等8个基因的DNA序列，构建了南洋杉科的分子系统树，确定瓦勒迈杉属与 贝壳杉属聚在一支，南洋杉属单独分为一支。 1993年，叶绿体DNA的限制性内切酶酶切图谱曾被用于研究草坪草及禾本科作 物的系统进化关系。M. Yaneshita等人采用PstI、BioI和BamH I三种酶构建了包括5 禾中冷季型草评草(Agrostis stolonifera、Lolium multiflorum、Festuca arundinacea、 Festuca rubra、Poa pratensis)、6 禾中暖季型草评草(Cynodon dactylon> Chlor is gay ana > Eragrostis eurvula> Zoysia japonica> Eremoehloa ophiuroides、PaspaIum notatum) 禾口 4 禾中(Triticum aestivum> Hordeum vulgate> Zea mays、Oryza sativa) 的禾本科14个种的酶切图谱，聚类结果显示，草坪草分为三大支，全部的冷季型草坪草聚 为一支，暖季型草坪草分为画眉草亚科(Eragrostoideae)和黍亚科(Panicoideae)两个 大支，除了黑麦草属和羊茅属外，其他聚类关系均与传统分类学相一致。羊茅属的高羊茅 (Festuca arundinacea)与多花黑麦草(Lolium multiflorum)聚为一支，而后才与紫羊茅 (Festuca rubra)聚为一个大支，这与传统分类学关系相悖。此后，很多叶绿体基因rbcL、 ndhF、rpoC2、rps4和核基因rDNA序列也被用来研究禾本科的系统发育关系。2000年，Sarah Mashews对禾本科51个种属的光敏色素B (phytochrome B, PHYB)的核DNA序列进行系统 发育分析，构建了禾本科物种的PHYB基因树，拓扑结构显示其基部主要分支结构与之前报 道的叶绿体基因树相符，且对于近缘种有更高的区分度，可以将rbcL基因无法区分的竹族 (Bambuseae)、稻族(Oryzeae)和早熟禾族(Poeae)内姐妹群的进化关系加以辨别。2007 年，Christopher Saski 全面考察了包括 Hordeum vulgare> Sorghum bicolor> Agrostis. Stolonifera> Oryza sativa>Oryza. nivara>Saccharum hybrids Saccharum officinarum> Triticum aestivum和ka Mays在内的九种重要禾本科植物叶绿体基因组，利用61个蛋 白质编码基因分别以最大简约法(maximum parsimony method)和最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树，拓扑结构基本一致。2006年，张道远采用4种分子标 记技术对包括匍茎剪股颖、巨序剪股颖及红顶草在内的7种剪股颖共58个个体的遗传分化 和系统关系进行研究，筛选出9个RAPD引物、2个SSR引物、5个ISSR引物及1个SCAR标 记，采用最大简约法和距离法对7种剪股颖植物进行系统树分析，其中匍茎剪股颖和红顶 草构成单系类群并得到100%的置信支持，红顶草显示了匍茎剪股颖特异性特征谱带，但同 时具有不同于匍茎剪股颖的遗传分化，认为红顶草为匍茎剪股颖一个变种。2009年，尚以顺 等采用ISSR标记技术，对贵州的4个匍匐剪股颖居群共2本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．辅助鉴定翦股颖属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）植物的引物对，由序列表的序列１所示ＤＮＡ和序列表的序列２所示ＤＮＡ组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐吉臣，徐倩，徐筱，白晨喜，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11