本发明专利技术公开了一种三日型猴疟动物模型，即通过猪尾猴疟原虫CCTCC?NO.V201021感染健康猴或免疫缺陷猴。所采用的猪尾猴疟原虫(Plasmodium?inui)即三日型猴疟原虫，定名为猪尾猴疟原虫中国株H(Plasmodium?inui-China?Huang)。本发明专利技术还公开该动物模型的建立方法，可通过按蚊传染途径或血液传染途径感染各种类健康猴而得，可长期反复传代使用。本发明专利技术为疟原虫的生理学、病理学、免疫学、药理学和分子生物学等方面的研究提供了一种理想的动物模型，也为深入研究三日型疟疾奠定了基础，给设计或筛选针对性抗疟药物提供了可靠依据。
Three day type monkey malaria animal model and its establishment method
The invention discloses a three type of simian malaria animal model by Plasmodium inui CCTCC? NO.V201021 infection or immunodeficiency healthy monkey monkey. The Plasmodium inui (Plasmodium? Inui) is the three day monkey named parasite, Plasmodium inui Chinese strain H (Plasmodium? Inui-China? Huang). The invention also discloses a method for establishing the animal model, which can infect various health monkeys through the transmission route of Anopheles or the way of blood infection, and can be used repeatedly for a long time. Provides an ideal animal model for the study of the present invention is the parasite physiology, pathology, immunology, pharmacology and molecular biology etc., also lays a foundation for further study on three types of malaria, and provide reliable basis for antimalarial drugs to the design or selection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在中国境内野生猴体内发现的一株猪尾猴疟原虫中国株 H(Plasmoiuminui-China Huang)即三日型猴疟原虫，并可通过人工饲养的按蚊传染或直接血液传染给健康猴，建立起非人灵长类疟原虫动物模型，尤其是一种。
技术介绍
疟疾仍然是目前世界上引起人类发病率和死亡率最高的疾病之一，据世界卫生组织的报道每年全球约有250-350万人死于疟疾的感染。我国每年大概发现有74万多的疟疾病人，并出现有恶性疟病人对传统抗疟药物产生抗性的病人，北方五省(苏、鲁、豫、皖、鄂) 的疟疾发病率出现回升并有局部的爆发点，因此，国内外均在加紧对疟疾的研究。在对疟疾的研究过程中，非人灵长类动物是研究人类疟原虫十分重要的动物模型，而能将人类疟原虫感染给大猩猩及南美洲的夜猴(Aotus monkey)的动物模型其数量稀少价格昂贵且不易获得。因此，在过去100多年里各国科学家通过努力发现在世界范围内广泛分布的猕猴中寻找出多种猴疟原虫，通过生物学的观察分类发现不同种类的猴疟原虫与人类不同种类的疟原虫不论是红细胞内各期疟原虫形态和裂变周期，还是在蚊体内发育均具有着十分相似的生物学特征，为此各国均建立起了不同种类的猴疟动物模型。尽管如此，从猴分离的疟原虫按人疟原虫的分类法分为恶性疟型、间日型和三日型等，依据是红细胞内期裂体增殖循环周期，而目前国内建立的猴疟动物模型主要是从国外引进的间日型疟原虫，如中国医学科学院建立的食蟹猴疟原虫属于间日型猴疟(张家埙等.一种猴疟原虫的鉴定报告.动物学报，1980，沈140.)，又如二军医建立的猴疟模型(戴祖瑞等.食蟹猴疟原虫B株-斯氏按蚊-恒河猴猴疟模型在国内的建立.中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 1987,5(3) :197-198)，同样属于间日型猴疟。因此，这给深入研究不同类型疟疾及其免疫带来了困难，也阻碍了针对性抗疟药物的开发进程。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便、重现性好、易于保种的，为深入研究三日型疟疾奠定了基础，也为设计或筛选针对性抗疟药物提供了可靠依据。为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案通过猪尾猴疟原虫CCTCC NO. V201021感染健康猴或免疫缺陷猴。三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法包括如下步骤<1>取猪尾猴疟原虫CCTCC NO. V201021保种猴静脉血输血感染免疫缺陷猴；<2>对步骤<1>被血传感染的免疫缺陷猴进行饲养观察，当采血镜检发现血内疟原虫配子体计数达64个/100WBC且雄雌配子体比例为1 2时，从感染猴静脉取血并抗凝而后给大劣按蚊雌蚊吸血感染；<3>将步骤<2>吸血大劣按蚊雌蚊饲养观察，当在解剖镜下解剖发现吸血蚊唾液腺中出现成熟子孢子后，取感染蚊自然感染健康猴；<4>按蚊感染健康猴后饲养观察，当采血镜检监测发现红细胞内有疟原虫即得。步骤<3>中出现成熟子孢子的时间为大劣按蚊吸血感染后第11 13天。三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法通过抽取带有猪尾猴疟原虫CCTCCN0. V201021保种猴的感染血并抗凝后，经静脉注入健康猴体内，感染3-5天后血检健康猴发现血内有疟原虫即得。三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法采用复苏后的猪尾猴疟原虫CCTCCN0. V201021保种猴静脉血，经静脉注入健康猴体内，感染3-5天后血检健康猴发现血内有疟原虫即得。复苏是取液氮冻存的猪尾猴疟原虫CCTCC NO. V201021保种猴静脉血冰冻管，放入 36°C的水浴箱中，待10-15分钟冰冻管回温即可。保种猴静脉血的制备是从患病猴静脉取血利用肝素抗凝后，采用无菌含30%甘油与抗凝血按1 1比例混勻后，分装入1.5毫升的冰冻管中，冻存于液氮罐中保种备用。本专利技术采用的猪尾猴疟原虫系中国广西境内发现的一株野外自然界的猪尾猴疟原虫，通过将其感染给人工饲养的中国海南岛大劣按蚊(Anopheles dirus)，再由按蚊传染给健康猴，经生物学观察和分子生物学试验鉴定属猪尾猴疟原虫种(Plasmoium inui)即三日型猴疟原虫，并定名为猪尾猴疟原虫中国株!!(Plasmodium inui-China Huang)。本专利技术将该株猴疟原虫通过实验室人工饲养的被感染大劣按蚊(海南岛)或感染有该猴疟原虫的血液感染各种类健康猴建立起的动物模型，感染有疟原虫的猴血可以置于超低温长期保种，亦可长期反复在健康猴中传代使用并用于各种有关疟疾方面的试验研究。建立模型主要是通过抽取保种猴带有疟原虫的静脉血，然后通过静脉注射给健康猴或免疫缺陷猴使其感染。本专利技术能方便地反复制备保种的感染源，易于永久保藏于实验室随时备用；经典按蚊途径传染健康猴过程中，观察疟原虫形态学特征指标以确定具有完整疟原虫生活史链的三日型猴疟动物模型的成功建立；分子生物学方法的采用可进一步从分类学角度，保证所得猴疟模型中疟原虫分子种属地位明确。本专利技术为三日型疟原虫的药理学、 病理学、免疫学、生物学及分子生物学等学科方面研究提供了科学可靠的非人灵长类动物模型及其建立方法。附图说明图1是三日型猴疟原虫在红细胞内各期形态图。图2是三日型猴疟原虫在大劣按蚊体内发育的子孢子荧光染色图。图3是三日型猴疟原虫在红细胞内环状体密度的变化曲线图。图4是三日型猴疟原虫生物进化树图A。图5是三日型猴疟原虫生物进化树图B保藏信息说明猪尾猴疟原虫中国株!!(Plasmodium inui-China Huang)，液氮法保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCN0. V201021，保藏日期为2010年12月四日。具体实施例方式在中国广西境内购买5只在当地山区所捕获的野生猴，均为雄性，包括恒河猴(Macacamulatta)和猪尾猴(Macaca nemestrina)各2只，食蟹猴 (Macacafascicularis (Raffles, 1821))1只。用于实验室试验前2个月的动物检疫观察期间进行包括体重、结核、动物肠道寄生虫、血内寄生虫检查和血清学检查，结果在食蟹猴血片镜检中发现有类似原虫类的小滋养体和大滋养体存在，但血内原虫密度很低，厚血片镜检平均每20个视野1个原虫。对该猴血清进行疟疾间接荧光抗体试验(IFAT)，抗体滴度结果为1 1观0(正常值应小于1 40)。为确认该原虫是否属于猴疟原虫或其它原虫类如猴肝囊原虫，准备将该猴血通过静脉传染给免疫缺陷猴(即切除脾猴)体内进行试验观察， 具体如下一、材料方法1. 1试验用按蚊1. 1. 1大劣按蚊来源与饲养大劣按蚊(Anopheles dirus)源于中国海南岛，经海南省疾病预防控制中心在实验室驯养传代，引进后在温度为26士 1°C和相对湿度为75% 士5%，光照时间为12:12小时养蚊室中饲养，并长期传代饲养用于试验。1. 2试验动物1. 2. 1野生猴疟传染给健康的切脾猴恒河猴2只，雄性，体重4. 5-5Kg,经动物检疫正常，疟原虫血检及疟疾IFAT检查均为阴性。对该猴进行外科无菌手术切除脾脏，该手术由具有兽医外科资格的主治医师按照广西壮族自治区试验动物使用和保护协会条例，在无菌的手本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种三日型猴疟动物模型，其特征在于：通过猪尾猴疟原虫ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１０２１感染健康猴或免疫缺陷猴。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄亚铭，崔立旺，傅伟忠，韦海艳，林康明，毛玮，区德锦，邹春燕，谢莉萍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：45
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