本发明专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及马铃薯Y病毒(Potato?virus?Y，简称PVY)的快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。该快速检测试剂盒包含采样管、漂洗管、核酸变性管、扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、快速干燥液、分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管等，形成的检测方法简化了操作步骤，降低了实验成本，在田间或室内具有更强的实用性。
Kit for detecting potato Y virus and detection method thereof
The invention relates to the field of virus detection, in particular to a fast and highly sensitive detection kit for potato Y virus (Potato, virus, Y, PVY) and a detection method thereof. The rapid detection kit includes a sampling tube, pipe, tube, rinse nucleic acid denaturation test tube, negative control tube, positive control, quick drying liquid, were encapsulated in the aseptic bag in FTA diaphragm, grinding rod, toothpicks and etc. Straw amplification, detection method of operation is simplified, the cost was decreased. It has higher practicability in the field or indoor.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及马铃薯Y病毒(Potato virus Y，简称PVY)的 快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
马铃薯Y病毒的基因组是单一 RNA正链，其粒体为微弯曲线状，大约长680 900nm,宽11 12nm。从1953年起马铃薯Y病毒在欧洲尤其在马铃薯广泛种植的地区流 行，20世纪70年代在美洲扩展，中国东北烟区、黄淮地区和西南烟区等都有发生。如果在烟 草移栽4周内感染马铃薯Y病毒脉坏死株系，可导致绝产绝收，即使在临近收获期感染该病 毒病，也会导致25 45%的损失，此外更为严重的是烟草病叶烤晒后色泽和烟味较差，其 品质大为降低。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测PVY，加强烟草育苗和田间环境的 监测，以预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国烟草行业健康持续发展就显得尤为迫切和 重要。目前用于烟草病毒检测的方法主要有生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技 术(ELISA)以及分子生物学等方法生物学方法主要是鉴别寄主反应或指示植物等，这种 仅仅以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法，虽曾广泛运用，却由于其检测速度慢、受环 境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒 粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；酶联免疫吸附技术(ELISA)虽具简便、快速等优 点，但灵敏度较差，且存在非特异性反应，在PVY尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体 法检测出来；上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测烟草普通花叶病毒。近年来发展 起来的以分子生物学技术为基础的病毒检测方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板杂交等 检测方法，克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了烟草普通花叶病毒的相对 快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR 检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了 RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。进行马铃薯Y病毒早期检测并采取预防措施是烟草生产中降低烟草花叶病毒流 行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法， 并开发适于现场应用的马铃薯Y病毒检测试剂盒就显得极为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的马铃薯Y 病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有 技术的不足，使PVY的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。首先，本专利技术针对PVY的衣壳蛋白基因中保守区段设计4条特异引物，利用反转录 酶和DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可 同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对PVY的快速和高灵敏检测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在田间开展，本专利技术对PVY的检测方法进行了优化。现在技术中，在用FTA卡 (英国Whatman公司)制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品勻浆液润湿的FTA膜片在 室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本专利技术通过在被样品勻浆液润湿的FTA膜 片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇 等)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸 制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加 核酸染料以判断检测结果。由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核 酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；已有报道和已公开 专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却 增加了成本。本专利技术通过在用于扩增反应的小管内预置染料的方法，可有效消除污染风险， 又不增加成本。本专利技术采用两种方法解决上述问题，其一是将金属离子与钙黄绿素形成的 配合物(即染料)与扩增反应液预先混合，置于扩增反应小管内；其二是先将核酸染料粘附 到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应 液和核酸染料混合；这样反应结束后无须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除 了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风 险。现在技术中，在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英 国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片。本专利技术无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水 漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。为了使本专利技术的检测方法在田间或室内具有更强的实用性，本专利技术在上述优化整 个检测方法的基础上，将检测PVY病毒所需的试剂及器材进行了组装、配套，使之标准化， 形成了检测试剂盒。本专利技术的马铃薯Y病毒快速检测试剂盒包含(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装灭菌蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下扩增引物 的上游引物1和下游引物1各1 2 μ M，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0. 1 0.4“] ，(^1 、(1111\( ^13和(1013各0.8 2.OmMjMgCl2 4 10mM，Betaine (甜菜碱)0. 6 1.2M, Tris-HCllO 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4 1 4mM，(NH4)2SO4 6 12mM，Triton X-1000. 05% 1. 0% (质量体积比)，反转录酶1 20U，Bst DNA聚合酶2 20U ；染料可 以是金属离子与钙黄绿素形成的配合物(金属离子/钙黄绿素摩尔比例为5 0.5 1，优 选为钙黄绿素和氯化锰形成的配合物)，也可以选核酸染料，只需其中一种即可；金属离子 与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中；核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧 上方或扩增检测管盖子内侧，核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限 于 SYBR Green I、GelRed、GelGreen、GoldView、GeneFinder 等；(5)阴性对照管，内装无烟草花叶病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了烟草花叶病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。上述的扩增引物是根据PVY衣壳蛋白保守区序列设计的，其核苷酸序列如下 上游引物 1 :5' -ACCCACATCCCGCAGATTTCGTTTTATGCGCAACMAAAGGAACC-3，(SEQ ID NO 1)下游引物1:5' -ACATCACGAACACCAGTGAGGGTTTTTTTCAATGCTGCGGCCTTC-3，(SEQ ID NO 2) 上游引物 2:5' -CTCAGATGTTGCAGAAGCGT-3，(SEQ ID NO 3) 下游引物 2:5' -AAGTCGAGGTTGGGCTGA-3，(SEQ ID NO :4)。 用本专利技术的检测试剂盒检测PVY的方法，包括下列步骤(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于快速检测马铃薯Ｙ病毒的试剂盒，其特征在于包含：（１）采样管，用来盛放、研磨待检样品；（２）漂洗管，内装灭菌蒸馏水；（３）核酸变性管，内装ＴＥ缓冲液；（４）扩增检测管，内装扩增反应液和染料；（５）阴性对照管，内装无烟草花叶病毒核酸的ＦＴＡ膜片；（６）阳性对照管，内装吸附了烟草花叶病毒核酸的ＦＴＡ膜片；（７）快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；（８）分别封装于无菌袋中的ＦＴＡ膜片、研磨棒、牙签和吸管；所述ＴＥ缓冲液含１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ和１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０所述的扩增反应液组成成分如下：如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的上游引物１和如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的下游引物１各１～２μＭ，如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的上游引物２和如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的下游引物２各０．１～０．４μＭ，ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ和ｄＣＴＰ各０．８～２．０ｍＭ，ＭｇＣｌ２ ４～１０ｍＭ，甜菜碱０．６～１．２Ｍ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０～４０ｍＭ，ＫＣｌ １０～２０ｍＭ，ＭｇＳＯ４ １～４ｍＭ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６～１２ｍＭ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ０．０５％～１．０％（Ｗ／Ｖ），反转录酶１～２０Ｕ，Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶２～２０Ｕ；所述的染料是氯化锰与钙黄绿素形成的配合物，或者是核酸染料。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳华，王志德，戴培刚，张兴伟，任民，罗成刚，牟建民，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：95
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