用凝血酶肽衍生物刺激骨生长制造技术

公开的是在需要骨诱导的患者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用凝血酶肽衍生物刺激骨生长的制作方法政府支持本专利技术全部或部分是由国家健康研究院的I R43 AR4550801和2 R44 AR45508-02援助基金的资助。政府在本专利技术中有一定的权利。相关的申请本申请要求保护2000年7月19日递交的美国临时申请第60/219,300号的权益，其全部内容通过在此引证而合并于本文。
技术介绍
哺乳动物骨组织具有明显的再生能力，从而修复损伤和其他缺陷处。例如，骨生长通常足以引起最简单的和细微的骨折完全恢复。但是，不幸的是，在许多损伤，缺陷或症状中，骨生长是不能恰如其分地获得可接受的结果的。例如，在大的空间，通常不发生骨再生。所以，骨折不能愈合，除非这些碎片是在近处。如果损伤的结果丢失了明显量的骨组织，愈合过程可能是不完全的，导致不如意的外观和/或机械的结果。这经常是非联合的骨折或来自大的创伤的骨损伤。组织生长通常在例如外科除去肿瘤或囊腔引起的骨中的空隙中也是不适当的。在其他情况中，可能需要刺激骨不正常的，即异位的生长。当两个或多个脊柱骨诱导融合时，脊柱融合释放更低的背部疼痛是一个需要的异位骨形成的例子。通常，裂隙和区段缺陷需要骨移植来成功地修复或裂隙填充。开发有效的骨移植取代方法将消除在移植过程中从第二外科位点收获骨的需要，从而明显地减少患者经受的不舒服，和发生供体位点愈合综合症的危险。在那些通常无法发生骨生长的未经处理的位点中刺激或诱导骨生长的化合物是“骨诱导”性的。骨诱导化合物作为处理如上所述的症状的药物具有巨大的价值。许多骨诱导蛋白质已经利用重组技术鉴定，分离和表达。例子包括在WO95/16035中的美国专利号5,902,705中公开的骨形态蛋白质(BMP)。但是，利用重组蛋白质作为治疗试剂通常具有许多缺点，包括生产的耗价，体内生物降解和短的半衰期。随后，科学家连续地研究没有前面提到的缺点的新的骨诱导试剂。专利技术的概述已经发现，激活非蛋白质凝血酶受体的化合物是骨诱导的。例如，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的激动剂刺激雄性新西兰兔子的尺骨中产生的区段性关键大小的缺陷处(实施例2)。正如X衍射所示，和组织学和机械测试证明，在与未处理的对照比较时，剂量100ug和200ug的TP508诱导的骨形成中有明显的增加。根据这些结果，本文公开了受试者中刺激骨的生长的新方法和新的可移植药物组合物。本专利技术的一个实施方案是在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法。该方法包括对该位点给药治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。本专利技术的另一个实施方案是含有可移植的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的药物组合物。本专利技术的方法涉及在受试者中刺激骨生长，并且可以用于不发生骨生长，没有用自身骨移植治疗或给药骨生长因子的位点。该方法包括给药非蛋白质水解的凝血酶受体的激动剂。这样的激动剂包括与人的前凝血酶的氨基酸508到530之间的区段有同源性的小肽。这些小肽并不昂贵，可以大量制备，并且在低剂量时也是骨诱导的。另外，它们的冻干形式当在5℃和60％的相对湿度下，至少在30个月中是稳定的。本专利技术的详细说明“骨诱导”指如果位点保持未处理，在很少或没有骨生长的受试者中的位点刺激骨生长。可以从骨生长的诱导得到治疗益处的位点认为是“需要骨诱导的”。例子包括非联合性的骨折或其他严重的或大面积的骨损伤。应该注意到，骨生长通常发生在骨损伤的时候，如简单的或细微的骨折和只有小裂隙的对抗很好的复合骨折，不需要其他治疗。这样的损伤不认为是“需要骨诱导的”。简单的骨折修复似乎是与填充非联合性的骨折，区段性裂隙或除去骨肿瘤或囊引起的骨空腔需要的骨形成的诱导是非常不一样的。这些情况中需要骨的移植或新的骨生长的诱导，通常利用了一些类型的基质或支架作为骨生长的替代物。已诱导的骨生长也可以在受试者中的一些位点具有治疗优势，这些位点指“异位”位点，其中通常没有发现骨组织，如需要骨移植或骨融合的位点。融合通常用于治疗通过物理地结合一个或几个椎骨和它们的四周来治疗的较低的背疼痛。这样的融合产生的骨定位于通常不是骨组织占据的位点。在这些异位位点的骨诱导可作为“移植取代物”，从而在脊柱之间诱导骨生长，取代移植体的位置，避免了二次手术收集移植过程中的骨。骨生长的诱导也是治疗后天的和先天的craniofacial和其他骨骼或牙齿畸形所需要的(参见，例如，Glowacki et al.，Lancet 1959(1981))；进行牙齿和牙周的再构建，其中需要失去的骨的替代或骨的增大如颌骨；补充牙周疾病产生的牙周骨的损失，推迟落牙(参见例如，Sigurdsson et al.，牙周杂志，66511(1995))。申请人已经发现，刺激或激活非蛋白质水解激活的凝血酶受体的化合物(下文中称为“NPAR”)是骨诱导的。这样的化合物称为NPAR激动剂。NPAR是大多数细胞表面上存在的高亲和力凝血酶受体。这一NPAR成分是负责凝血酶，蛋白质水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽与细胞的高亲和力结合的。NPAR似乎是介导不依赖它的蛋白质水解活性的凝血酶启动的许多细胞信号的。一个这样的信号的例子是膜联蛋白V和消减杂交鉴定的其他分子的上调(参见Sower，et al.，实验细胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，它在细胞表面与凝血酶有高亲和力反应，并且它被凝血酶和如下所述的凝血酶派生的肽激动剂的蛋白质水解失活的衍生物激活。NPAR激活可以根据当在存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C或与125I凝血酶高亲和力结合竞争凝血酶受体的分子时，加到成纤维细胞中时刺激细胞的繁殖的能力来进行测试，如美国专利号5,352,664和5,500,412和Glenn et al.，肽研究杂志，165(1988)中所述。NPAR是与其他凝血酶结合蛋白质和凝血酶的蛋白质水解激活受体的克隆家族，包括PAR1，PAR2，PAR3和PAR4受体是有区别的。PAR1具有特异的凝血酶裂解位点，允许裂解凝血酶暴露新的氨基末端区，作为在其自身回折诱导它的激活的黏连配体(参见，Vu et al.，细胞641057(1991))。PAR2具有相似的激活机制，但原则上是胰蛋白酶类似酶激活的(参见，Zhong，et al.，生物化学杂志，26716975(1992))。PAR3也具有相似的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，et al.，自然386502(1997))。PAR4已经在小鼠巨核细胞中检测，研究表明，它也在人血小板中起作用(参见，Kahn，et al.，自然，394690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活不需要蛋白质水解的裂解。几个证据表明，NPAR是与PAR受体不同的(1)细胞的群体已经分离，完全表达了功能性PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷，所以对凝血酶没有应答(参见，Kim，et al.，细胞生理学，160573(1994))；(2)嗜中性粒细胞以高亲和力结合125I凝血酶，它们的趋化性是受蛋白质水解激活的凝血酶或NPAR激动剂刺激的(参见，Ramakrishnan和Carney，细胞分子生物学41993(1993))，但是它们不表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。

【技术特征摘要】
US 2000-7-19 60/219,3001.一种在需要骨诱导的受试者中的位点中刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该位点给予治疗有效量的非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是需要骨移植的。3.根据权利要求1所述的方法，其中该位点是骨中的区段性裂隙，在非联合的骨折中的骨空腔。4.根据权利要求1中所述的方法，其中激动剂是包括下面的结构式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有12到23个氨基酸。6.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其至少具有6个氨基酸的C末端截断的片段，假设，在丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3个氨基酸与SEQ ID NO1中对应位置的不同。7.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸保守序列具有SEQID NO1所述的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9个氨基酸的C末端截断的片段，假设丝氨酸酯酶保守序列中的0，1，2个氨基酸是SEQ IDNO1中的对应的氨基酸的保守取代。8.根据权利要求5所述的方法，其中丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu或Gln和X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截断的片段，所述的片段至少具有6个氨基酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的氨基酸序列。10.根据权利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列，Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1-是Glu或Gln和X2-是Phe，Met，Leu，His或Val。11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列，Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2，或3个氨基酸与SEQ ID NO5的对应的位置中的氨基酸不同。12.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截断的片段，假设在凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2个氨基酸是SEQ ID NO5的对应位置中的氨基酸的保守取代。13.根据权利要求11所述的方法，其中凝血酶肽的衍生物是另外包括在可移植的，可生物兼容的载体的药物组合物中给药的。14.根据权利要求13所述的方法，其中可植入的，可生物兼容的载体是骨传导的基质。15.根据权利要求11所述的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。16.根据权利要求1所述的方法，其中受试者是农场动物，伴侣动物或实验室动物。17.一种药物组合物，其包括可植入的，可生物兼容的载体和非蛋白质水解激活的凝血酶受体的激动剂。18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中载体是骨诱导的。19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中凝血酶受体激动剂是凝血酶肽衍生物，包括下面的结构式代表的多肽Asp-Ala-R；其中R是丝氨酸酯酶保守序列。20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体是可生物降解的合成多聚物。21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中可生物降解的合成多聚物是聚乳酸/聚乙醇酸同聚物或共聚物。22.根据权利要求19所述的药物组合物，其中载体包括胶原，纤维蛋白，磷酸钙盐，硫酸钙，胍萃取的异...

【专利技术属性】
技术研发人员：达芮尔H卡尼，罗杰S库劳泽尔，戴维J西蒙斯，杨金萍，威廉R雷丁，
申请(专利权)人：奥索洛吉艾斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]