甘露糖结合凝集素及其应用制造技术

本发明专利技术表明缺少ＭＡＳＰ的ＭＢＬ能够从血浆中补充ＭＡＳＰｓ，并且能够成功地激活补体级联反应。此外，本发明专利技术发现与缺少ＭＡＳＰ的ＭＢＬ相比，纯化的ＭＢＬ复合体具有有限的激活补体级联反应能力。因此，本发明专利技术提供了一种药物组合物，其包含分离的非重组性甘露糖结合凝集素（ＭＢＬ）以及制药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶（ＭＡＳＰｓ）相交联的ＭＢＬ。同时，本发明专利技术还提供了一种治疗需要ＭＢＬ的受试者的方法，包括了给受试者施用有效剂量的本发明专利技术的药物组合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及纯化的甘露糖结合凝集素(MBL)及其在治疗中的应用，上述甘露糖结合凝集素中基本不含有与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相缔合(associated)的MBL。
技术介绍
甘露糖结合凝集素(MBL)，有时称为甘露聚糖结合凝集素或甘露糖结合蛋白，是一种来源于肝脏的C型血清凝集素，其与补体成分Clq具有结构上的同源性。MBL可以通过凝集素和经典途径激活补体，并且能够与噬菌细胞表面特异的Clq类受体相互作用，因此它在首要的宿主防卫体系中起着非常重要的作用。MBL属于胶原凝集素(collectin)蛋白家族的成员，这类蛋白中不仅存在胶原区域，而且也具有球状凝集素区域。MBL的结构单元是由3个32kDa亚单元组成的96kDa胶原蛋白三股螺旋，其中每一个亚单元都具有碳水化合物识别区域，上述螺旋通过N末端半胱氨酸之间的二硫键实现稳定作用。多个这种96kDa单元组成了MBL寡聚体，天然蛋白通常以三聚体到六聚体的形式存在，分子量在270kDa到大约650kDa之间。MBL只有在以较高寡聚体形式存在时才能获得其全部功能。目前已有证据表明MBL至少必须以四聚体的形式存在才能有效地进行补体激活。这种寡聚体结构使MBL有多个配体结合位点，并且可以摹拟IgM的多重结合特性。MBL可以和多种不同的糖类进行结合，但其最强烈地与甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖相结合。上述糖类大量存在于许多病原菌的细胞壁上，例如酵母、革兰氏阴性肠道细菌、革兰氏阳性细菌、分枝杆菌、一些病毒和特定的寄生虫等。多数的MBL糖类靶都不在哺乳动物细胞表面进行高密度的表达，同时MBL还具有自身和非自身识别的能力，因此在首要的宿主防卫体系中，MBL可以作为一种模式识别分子发挥作用，称之为先天性免疫系统的核心部分(Turner，1996)。MBL具有高效而有力的补体激活功能，和其激活功能的核心与体内至少两种原酶密切相关联，它们分别称为MBL关联(associated)丝氨酸蛋白酶1，2和3(MASP1，MASP2和MASP-3)。当MBL与它们各自的配体相结合，并且通过凝集素途径启动有效的补体激活作用时，上述分子量分别为93kDa、76kDa和105kDa的单一多肽就分别转换为活性形式(Turner，1996)。研究表明MAPS2是补体激活作用所必须的，该酶能在缺少MASP1或最近记述的MASP3时单独起始补体级联作用，因此MASP2是与MBL启动补体级联激活作用相关联的至关重要的酶类。MBL基因(MBL2)位于第10号染色体的10q11.2-q21上，它包含4个外显子。已经记述了多个影响功能蛋白表达的MBL2突变体。目前认为MBL2基因外显子1中密码子52、54和57处的单核苷酸取代作用破坏了MBL亚单元组装成其基本的三聚体结构单元。此外，目前至少描述了两个可以改变个体MBL亚单元表达水平的启动子区域多态性(分别在位置-550和-221处)。在不同的人种群中MBL基因突变的频率也不同。例如在高加索人(Caucasians)中，密码子54处突变体发生的频率为15％，而仅仅在非洲人中才会出现密码子57处发生突变的变体。基因突变和启动子多态性共同发生的实际意义在于在普通人群中发生MBL缺乏是相当普遍的。在具有野生型基因的纯合个体中，血清中MBL的水平为1到5μg/mL；在MBL2基因发生突变的纯合个体中，血清中MBL的水平为5到25ng/mL；在杂合个体中，血清中MBL的水平为常规的1/8，但是也存在有相当大的变化。许多线索表明MBL缺乏可以导致重大的临床后果。1968年，人们认为孩童时期反复感染、不能健壮发育以及慢性腹泻等综合症状与体外血浆中缺乏调理素有关。后来的研究证明这种综合症状与10个年龄在15个月到9岁的儿童低水平的MBL相关。通过对医院已确认发生感染的345个儿童进行连续的研究表明，MBL2缺乏是造成儿童感染的非常危险的因素之一。在已发生感染的儿童中，MBL2基因突变的发生率是未感染儿童的两倍，同时在杂合个体和纯合个体中都增加了易感染性。感染种类从胸部感染和耳炎直到威胁生命的脑膜炎球菌血症(meningococcaemia)。通过对266份病例的大量研究，已经证实了MBL缺乏与儿童流行性脑脊髓膜炎(meningcoccal disease)之间的相关性。7.7％的医院基础上的病例属于MBL多态性纯合型，而对照组为1.5％，让步比(odds ratio)为6.5。由此可以得出结论，全部病例中的1/3是由MBL发生遗传突变引起的。上述儿科群体中的数据产生了下面一种假设，即MBL的主要作用是在所谓的“易获病期”提供一种保护，而所谓的“易获病期”(window ofvulnerability)是指母体抗体丧失之后和婴儿自身抗体组成部分尚未成熟之前的这段时期(6个月到18个月)。最近的研究结果表明MBL基因型突变体与常见的可变免疫缺陷和急性成淋巴细胞白血病的早期发作和显现相关，上述结果有力地支持了以下假设，即当免疫系统中其它组分尚未成熟或受到损伤时，MBL介导的宿主防卫体系发挥着更重要的调节作用。最近对149个囊肿性纤维化(CF)受试者的研究表明，常见的MBL基因遗传突变与疾病严重性的增加和感染Burkholderia cepacia危险的增大相关。MBL突变体等位基因也与预后不良和夭折(early death)相关-与通常的CF群体中的纯合体相比，突变体等位基因携带者的预计存活时期也缩小了8年。MBL缺乏在成人中的重要性被越来越多的医疗证据所证实，通过对患有“严重且异常”感染的成人受试者(包括反复性皮肤感染、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)、具有反复性单纯疱疹和食管念珠菌病的流行性脑脊髓膜炎(meningococal meningitis)、以及Klebsiella pneumonia)的研究表明涉及了MBL2基因密码子52或54处的突变。在228个疑似具有非HIV相关性免疫缺陷的成人受试者中，杂合性MBL2基因突变的发生频率与对照群体相同，但是在上述疑似具有免疫缺陷的群体中，纯合性MBL2基因突变的发生频率却显著增加(8.3％对0.8％)。相关数据还显示出在男性MBL多态性纯合体中，感染HIV的危险性较大并且AIDS进展的比率也较快。在因采用化学疗法而使机体适应性免疫反应受到损害(compromise)的受试者体内，MBL结构基因突变后果和循环性MBL水平较低是与感染发生率和感染严重性的增加明显相关的。在因血液恶性肿瘤疾病而接受化学治疗的成人中，MBL水平低于0.5μg/mL的受试者感染的发生率和严重性都显著增加。人们发现在成人进行同种异体干细胞移植之后，供体和受体的MBL基因型对发生感染的风险起着重要的作用。在100个接受化学治疗的儿童中，与具有野生型MBL基因的儿童相比，那些具有MBL结构基因突变的受试者发生发热性嗜中性白血球减少症的天数是其两倍，而是那些因感染送入ICU的四倍。在此项研究中，MBL水平低于1μg/mL是一项关键因素。在预期的研究之中，还对研究地区的252名儿童进行了检查(Koch等，2001)，结果发现年龄在6个月到17个月的儿童中，MBL缺乏与急性呼吸感染显著相关(发生的风险增加两倍)，对年龄在0个月到5个月的儿童发生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物，其包含分离的非重组性甘露糖结合凝集素（ＭＢＬ）以及药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶（ＭＡＳＰｓ）相缔和的ＭＢＬ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2002-4-24 PS1961;AU 2002-12-13 20029533241.一种药物组合物，其包含分离的非重组性甘露糖结合凝集素(MBL)以及药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相缔和的MBL。2.按照权利要求1所述的组合物，其中MBL基本上不含有MASPs。3.按照权利要求1或2所述的组合物，其中MBL是人MBL。4.按照权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中的MBL通过下述方法获得(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)在适当的缓冲液中培养上述复合体，使MBL与一个或更多个MASPs发生解离；并且(iii)从一个或更多个MASPs中将MBL分离。5.按照权利要求4所述的组合物，其中步骤(ii)中的缓冲液是pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。6.按照权利要求4或5所述的组合物，其中步骤(ii)中的缓冲液包含NaCl。7.按照权利要求4至6中任意一项所述的组合物，其中步骤(iii)中包括层析方法和/或过滤。8.按照权利要求7所述的组合物，其中层析方法选自下组大小排阻层析和离子交换层析。9.一种生产药物组合物的方法，其包括(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)从至少部分的一个或更多个MASPs中使MBL发生解离；(iii)从至少部分的一个或更多个MASPs中使MBL分离；并且(iv)将第(iii)步产生的MBL与药学上可接受的载体或稀释剂相混合。10.按照权利要求9的方法，其中步骤(ii)包括在适当的缓冲液中培养复合体。11.按照权利要求10的方法，其中缓冲液是pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。12.按照权利要求10或11的方法，其中缓冲液中包含NaCl。13.按照权利要求9至12中任意一项的方法，其中步骤(iii)中包括层析方法和/或过滤。14.按照权利要求13所述的方法，其中层析方法选自下组大小排阻层析和离子交换层析。15.按照权利要求9至14中任意一项所述的方法，其中步骤(i)中包括从血浆分级过程中提供附加级分。16.按照权利要求15所述的方法，其中步骤(i)进一步包括了采用甘露聚糖亲和层析法从其它血浆蛋白中分离非重组MBL和一个或更多个MASPs复合体的步骤，其中所述其它血浆蛋白存在于血浆分级过程中产生的附加级分中。17.由权利要求9至16中任一项的方法所获得的药物组合物。18.按照权利要求17所述的药物组合物，其基本上不含有已激活的MASPs。19.一种在受试者中治疗或预防疾病的方法，其包括了给受试者施用有效剂量的权利要求1至8、17或18中任一项所述的药物组合物。20.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为骨髓同种异体移植接受者。21.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为免疫缺陷受试者。22.按照权利要求19所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷斯奥布赖恩，罗伯特N派克，梅林达M迪安，罗宾M明钦顿，特里萨M马蒂内利，
申请(专利权)人：昆士兰医学研究学院理事会，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]