非病毒类基因送递系统技术方案

本发明专利技术涉及一种含有阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物和核酸的组合物，其中，该阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到，除了重量分数少于２０％的聚合度（ＤＰ）＞５０的寡聚物外，它还含有重量分数小于２０％的ＤＰ＜１０的寡聚物。这些含有特定链长分布的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物和核酸的组合物有利于向选定组织的细胞送递核酸，并实现由所述核酸编码的所需分子的体内表达。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的用于送递核酸的非病毒类送递系统。更具体而言，本专利技术涉及一种系统，在给予宿主组织后，它促进核酸导入该宿主组织的细胞中。该系统是以含有特定化学和物理化学特征的、衍生自可生物降解的脱乙酰壳多糖多糖类的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物的组合物为基础，该组合物能有效地送递生物学活性核酸(如编码所需产品的寡核苷酸或聚核苷酸)，并促进所需产品在所述组织的细胞中表达。
技术介绍
基因治疗的概念是以核酸(DNA或RNA)可作为药物产品从而在适当位点引起治疗性蛋白质的体内生产为基础。通常将送递核酸的系统分为病毒类送递系统和非病毒类送递系统。由于其高度进化和特化的组分，病毒类系统是目前最有效的DNA送递工具，该系统可产生高效的送递和表达。但是，病毒类送递系统存在安全性问题。毒性、免疫原性、限于靶向特定细胞类型、有限的DNA携带能力、生产和包装问题、重组和非常高的生产成本都阻碍了它们的临床应用(Luo和Saltzman，2000)。为此，在基础研究实验室和临床应用中越来越需要非病毒类送递系统。但是，从制药学的角度看，由于与病毒类送递系统相比非病毒类送递系统在体内获得的表达相对较低，送递核酸的途径仍然是一个难题(Saeki等，1997)。现有技术已描述了多种非病毒类送递系统，包括阳离子脂质、肽或聚合物与质粒DNA(pDNA)形成的复合物(Boussif等，1995；Felgner等，1994；Hudde等，1999)。带负电的核酸主要通过离子-离子相互作用而与阳离子分子相互作用，并从游离形式转变形成紧密状态。在这种状态下，阳离子分子可提供针对核酸酶降解的保护，而且还使该核酸-阳离子复合物更易与细胞相互作用并被其摄取的表面特性(Ledley，1996)。在这些阳离子分子中，已显示合成的聚合物聚氮丙啶(PEI)能与pDNA形成稳定的复合物，并介导了转基因在体外和体内的相对高的表达(Boussif等，1995；Ferrari等，1997；Gautam等，2001)。为此，常用PEI作为试验设计的参比系统。但是，已提出PEI的毒性和效率之间的大致相关性(Luo和Saltzman，2000)，最近的研究还提出使用PEI所涉及到的毒性(Godbey等，2001；Putnam等，2001)。PEI的另一缺点是，它不是可生物降解的，因此，它可能被长时间存储在体内。因此，仍非常需要寻找有效、无毒的可生物降解的非病毒类送递系统。最常见的是通过肠胃外途径将非病毒类送递系统体内送递。静脉给予小鼠后，紧密的核酸-阳离子分子复合物主要沉积在肺毛细血管中，在那基因在肺泡隔膜(alveolar septi)中毛细血管的内皮细胞中表达(Li和Huang，1997；Ki等，2000；Song等，1997)，甚至在肺泡细胞中表达(Bragonzi等，2000；Griesenbach等，1998)，但是不在上皮细胞中表达。但未配制的裸DNA在达到目的地前在血液循环中快速降解，因此通常没有基因表达。相反，将裸DNA注射到骨骼肌肉则导致剂量依赖性的基因表达(Wolff等，1990)，当将该DNA与非紧密但“相互作用”的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA)复合时，这种基因表达进一步提高(WO 96/21470)(Mumper等，1996；Mumper等，1998)。因此，体内基因转染是组织依赖性的，其方式不可预测，因而这仍是个挑战。还描述了非病毒类送递系统的粘膜送递，即送递给胃肠道、鼻和呼吸道(Koping-Hoggard等，2001；Roy等，1999，WO 01/41810)。除了DNA以非紧密形式送递到鼻组织获得最佳的基因表达(WO 01/41810)外，当需要在粘膜组织中获得高基因表达时，紧密型核酸-阳离子分子复合物要优于非紧密型DNA。现有技术中，非病毒类送递系统是以分子量相当高的阳离子聚合物(如脱乙酰壳多糖)为基础的，通常具有几百个千道尔顿(kDa)，5kDa是下限(如MacLaughlin等，1998；Roy等，1999；WO 97/42975)。主要的原因是低分子量聚合物(＜5kDa)与DNA形成不稳定的复合物，导致基因表达少(Koping-Hoggard，2001)。但是，使用高分子量阳离子分子具有很多缺点，如紧密型核酸-阳离子分子复合物的聚集增加和溶解度问题(MacLaughlin等，1998)。此外，使用较低分子量的阳离子分子存在一些生物学优点，即与较高分子量的阳离子分子相比，它们通常显示出较低的毒性和较弱的补体激活(Fischer等，1999；Plank等，1999)。现有技术已描述了使用低分子量阳离子分子与核酸复合的一些例子(Florea，2001；Godbey等，1999；Koping-Hoggard，2001；MacLaughlin等，1998；Sato等，2001)。但是，这些低分子量阳离子分子与DNA形成不稳定的密合体(compact)，该密合体在电场中分离(琼脂糖凝胶电泳)，结果导致与较佳分子量阳离子分子相比没有体外基因表达或表达量很少。这可以解释为DNA和低分子量阳离子分子之间形成的复合物通常是不稳定的，易于解离(Koping-Hoggard，2001)。实际上，琼脂糖凝胶电泳期间阳离子分子-DNA密合体的离解和裸DNA的释放在文献中被用作区分无效制剂与有效制剂的试验(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。这样，现有技术已知DNA和阳离子之间形成的复合物必须稳定才能介导高的基因表达。现有技术公开了使用非病毒载体将核酸送递给呼吸道的方法的各种例子(Deshpande等，1998；Ferrari等，1997；Gautam等，2000)。我们最近鉴别和表征了基于DNA-复合性聚合物脱乙酰壳多糖的这样一种系统(Koping-Hoggard等，2001)，该脱乙酰壳多糖是一种线性多糖，可从壳多糖衍生得到。在美国专利5972707(Roy等，1999)、美国专利申请号2001/0031497(Rolland等，2001)和WO 98/01160中也描述了脱乙酰壳多糖基的基因送递系统。已将脱乙酰壳多糖作为紧密连接-修饰剂引入，以促进药物送递通过上皮屏障(Artursson等，1994)。认为它在给人口服后是无毒的，而且已被批准作为食物添加剂使用，并且还被加到愈创产品中(Illum，1998)。脱乙酰壳多糖包括一类由(1→4)-连接的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A单元)和2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcN，D单元)以各种组成和顺序形成的水溶性的线性多糖，可参见附图说明图1。在此采用的将壳多糖和脱乙酰壳多糖区分开的定义是以壳多糖在稀释的酸溶液中的不溶性和脱乙酰壳多糖在相同的稀释酸溶液中的可溶性为基础的(Roberts，1992)。A单元和D单元的相对含量可以A单元的分数表示 FA＝A单元数量/(A单元数量+D单元数量)FA与去-N-乙酰化单元的百分比具有以下关系％去-N-乙酰化单元＝100％-(1-FA)。每个D单元含有亲水性可质子化的氨基基团，而每一A单元含有疏水性乙酰基。两种单体的相对量(如A/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，含有以下组分的复合物：（ａ）从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物，其中，除了重量分数少于２０％的聚合度（ＤＰ）＞５０的寡聚物外，所述阳离子寡聚物还含有重量分数小于２０％的ＤＰ＜１０的寡聚物；和　 　（ｂ）核酸。

【技术特征摘要】
NO 2002-5-3 200221481.一种组合物，含有以下组分的复合物(a)从阳离子多糖脱乙酰壳多糖衍生得到的阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物，其中，除了重量分数少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，所述阳离子寡聚物还含有重量分数小于20％的DP＜10的寡聚物；和(b)核酸。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述阳离子壳多糖寡聚物是采用化学或酶学方法从脱乙酰壳多糖获得的。3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述阳离子寡聚物较佳除重量分数少于20％的DP＞40的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜12的寡聚物、最佳除重量分数少于20％的DP＞30的寡聚物外还含有重量分数少于20％的DP＜15的寡聚物。4.如权利要求1-3所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖寡聚物的N-乙酰化单元分数(FA)少于0.60、较佳少于0.35、更佳少于0.1，最佳少于0.01。5.如权利要求1-4所述的组合物，其特征在于，所述组合物基本上呈净正电荷比。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖寡聚物以靶向配体和稳定剂衍生化。7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复合物含有编码序列，当所述核酸被导入宿主细胞中时，所述编码序列表达其功能。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述核酸选自DNA和RNA分子。9.如权利要求8所述的组合物，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：P阿尔图松，BE克里斯顿森，M科平霍格德，KM瓦姆，
申请(专利权)人：FMC生物聚合物联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]