人血白蛋白的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提纯工艺方法，具体是一种人血白蛋白的生产方法。其主要特点是：用三步法进行分离，简化现有的分离工艺，提高了产品收率和生产效率，在压滤时加入合适比例的硅藻土作为助滤剂，提高过滤速度，改善过滤效果。加入层析步骤后，降低了人血白蛋白的多聚体含量，改进了人血白蛋白的稳定性，也控制了内毒素含量。产品的各项质量指标均超过国家标准。

Method for producing Human Albumin

The invention relates to a method for separating and purifying protein in biological product technology, in particular to a production method of Human Albumin. Its main features are: were separated by three steps, and simplify the separation of the existing technology, improve product yield and production efficiency, adding in proper proportion of diatomite filter as the filter aid, improve the filtering speed, improve the filtering effect. After the addition of chromatography step, the content of Human Albumin was reduced, the stability of Human Albumin was improved, and the endotoxin content was also controlled. Each quality index of the product exceeds the national standard.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提纯工艺方法，具体是一种。
技术介绍
人血白蛋白是人体血液中最主要的一种功能性蛋白质，其主要生理功能为调节人体渗透压和新陈代谢中物质运输，临床上主要用于治疗烧伤、烫伤及脑水肿和肝腹水等症。目前主要的分离方法是以乙醇为沉淀剂的低温乙醇法和柱层析法，现行的低温乙醇法主要存在着工艺复杂，步骤多(仅分离步骤就有5-6步)，分离周期长等缺点，工艺复杂、步骤多则生产不易控制，周期长则效率不高；另一方面，在分离中多数不加助滤剂，使过滤速度慢，过滤效果不好即固液分离不充分，还有少量的固体组分混在清液中，导致产品质量不易控制，而且该工艺生产的制品纯度不高，一般在96% 98%左右，多聚体含量较高， 约为2% 3%。柱层析法工艺虽然克服了以上缺点，但生产一次性投资大，生产成本高，不能灭活病毒等缺点，因此在大规模生产中较少被使用。专利申请号为200710035210. 4曾介绍了一种白蛋白工艺，其采用五步沉淀，而后三步分离，即组分I、组分Π+ΙΙΙ分别沉淀，再一起分离，组分IV-I、组分IV-4分别沉淀，一起分离，然后再沉淀和分离组分V，相对每批生产周期长，而且在压滤时未加助滤剂，这将使过滤慢，同时，过滤效果即固液分离不完全。我公司根据低温乙醇法和柱层析法的特点，进行了研究，专利技术了低温乙醇法结合柱层析法分离人血白蛋白的新生产工艺。该工艺使人血白蛋白的纯度达到98 % 100 %，人血白蛋白的多聚体含量小于3%，人血白蛋白的收率达到2. 8g 3. 0g/100ml血浆。
技术实现思路
本专利技术涉及到一种，其特征是以人血浆为原料，以三步分离法进行分离，即第一步直接分离组分Ι+Π+ΙΙΙ ；第二步直接分离组分IV ；第三步分离得到组分V，即白蛋白粗品，再经一步层析精制即得到人血白蛋白成品。本专利技术进一步的技术方案是以乙醇作为沉淀剂，其添加浓度为18% 42%。本专利技术更进一步的技术方案是组分V沉淀溶解后经过滤，调节离子强度、pH后， 用 DEAE Sepharose FF 柱层析。本专利技术更进一步的技术方案是以压滤机为分离设备进行固液分离，工作压力为 0. 5 2. 0 公斤 /cm2。本专利技术更进一步的技术方案是在进行固液分离时，加入硅藻土作为助滤剂，提高过滤效果，其添加的比例是全部过滤液的0. 5% 2% (g/ml)。本专利技术更具体的技术方案是第一步、分离组分I+II+III 将冰冻的人血浆在不高于37°C下融化，并调整温度到0 4°C，或者把新鲜的血浆直接调整到0 4°C，用PH值为4. 0的醋酸缓冲液调节血浆的PH值为5. 8 6. 2，加入95 %的乙醇，调节乙醇浓度到18 % 22 %，并降温到-4 -6°C，搅拌30 60分钟，静止1 2小时，加入硅藻土 2% (g/ml)，用压滤机进行分离，分离的清液入到另一反应罐中，压滤结束时打开压滤机收取组分Ι+Π+ΙΙΙ沉淀。第二步、分离组份IV 将分离组分I+II+III的清液调整温度在-3 -5°c，用PH 值为4. 0的醋酸缓冲液调节PH值为5. 8 6. 2，加入95%的乙醇，调节乙醇浓度到38% 42%，并降温到-4 -6°C，静止1 2小时，加入硅藻土 2% (g/ml)，用压滤机进行分离，分离的清液入到另一反应罐中，压滤结束时打开压滤机收取组分IV沉淀。第三步、分离组分V 将分离组分IV后的清液温度调整到-4 _6°C，用2M的醋酸调节PH值为4. 75 4. 85，搅拌1 2小时，同时调整温度到-8 -12°C，静止2 6小时，加入0.5% 1.0% (g/ml)的硅藻土到压滤机中，用压滤机进行分离，分离的清液进行回收乙醇，压滤结束时打开压滤机收取组分V沉淀，组分V即为人血白蛋白粗品。第四步、层析超滤用5 7倍量的温度为0 10°C的注射用水将组分V溶解，调节蛋白含量为3 % 5 %，调节pH为5. 2 5. 5，离子强度为0. 01 0. 02，过滤，用DEAE Sepharose FF柱层析，洗脱液用IM碳酸氢钠调节PH值为6. 20 6. 60，用超滤机进行超滤透析，并浓缩蛋白浓度到20. 2% 20. 5 %，加入辛酸钠作为保护剂，以巴氏灭活法灭活病毒，除菌过滤后分装即得成品。本专利技术的其主要优点是采用三步法进行分离，简化现有的分离工艺，提高了产品收率和生产效率，在压滤时加入合适比例的硅藻土作为助滤剂，提高过滤速度，改善过滤效果。加入层析步骤后，降低了人血白蛋白的多聚体含量，改进了人血白蛋白的稳定性，也控制了内毒素含量。产品的各项质量指标均超过国家标准。附图说明下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术工艺流程方框示意图。具体实施例方式实施例1 以IOOOkg血浆进行三步法分离白蛋白粗品为例第一步、分离组分I+II+III 将IOOOkg冰冻的人血浆在不高于37°C下融化，并调整温度到0°C，用PH值为4. 0的醋酸缓冲液调节血浆的PH值到5. 8，加入95%的乙醇，调节乙醇浓度到20%，并降温到_5°C，搅拌30分钟，静止1小时，加入硅藻土 1. 0% (g/ml)，用压滤机进行分离，分离的清液入到另一反应罐中，压滤结束时打开压滤机收取组分I+II+III， 得组分I+II+III沉淀约90kg，此步用时为10小时。第二步、分离组份IV:将分离组分I+II+III的清液调整温度在-3°c，用PH值为4. 0的醋酸缓冲液调节PH值到5. 8，加入95%的乙醇，调节乙醇浓度到40%，并降温到-4°C，静止1小时，加入硅藻土 (g/ml)，用压滤机进行分离，分离的清液入到另一反应罐中共约1500kg，压滤结束时打开压滤机收取组分IV沉淀为80kg。此步用时约10小时。第三步、分离组分V 将分离组分IV后的清液约1500Kg温度调整到_4°C，用2M的醋酸调节PH值到4. 75，搅拌1小时，同时调整温度到_8°C，静止2小时，加入0. 5% (g/ml) 的硅藻土到压滤机中，用压滤机进行分离，分离的清液进行回收乙醇，压滤结束时打开压滤机收取组分V沉淀约110kg，组分V即为人血白蛋白粗品。此步用时约15小时。如果每次投产IOOOkg血浆，采用本专利技术的三步法分离，得到白蛋白粗品——组分 V只需要35小时，比传统工艺的3-4天，生产周期大大缩短。第四步层析超滤用5倍量的温度为2°C的注射用水550kg将组分V沉淀IlOkg溶解，得溶解液660kg，取样测定蛋白浓度和白蛋白纯度，调节溶解液的蛋白含量为5%，pH值为5. 2，离子强度为0.01，进行过滤，过滤液入到另一个反应罐，用DEAE Sepharose FF柱层析，洗脱液用IM的碳酸氢钠调节pH值为6. 20，用超滤机进行超滤，去掉乙醇，并浓缩蛋白浓度到20. 5%，加入辛酸钠作为保护剂，得白蛋白液143L以巴氏灭活法进行病毒灭活，得到白蛋白原液，并取样测定白蛋白纯度，除菌过滤后分装既得成品。结果见表1.表1 层析超滤过程结果分析权利要求1.一种，其特征在于以人血浆为原料，以三步压滤分离法进行分离，即第一步直接分离组分I+II+III ；第二步直接分离组分IV ；第三步分离得到组分 V，即白蛋白粗品，再进行层析超滤配制即得到人血白蛋白成本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种人血白蛋白的生产方法，其特征在于：以人血浆为原料，以三步压滤分离法进行分离，即第一步直接分离组分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ；第二步直接分离组分ＩＶ；第三步分离得到组分Ｖ，即白蛋白粗品，再进行层析超滤配制即得到人血白蛋白成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李常禄，魏舒，孙晓东，杨金平，陈凤珠，于洋，郭晶，
申请(专利权)人：哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：93