本发明专利技术公开了一种抗EGFR人源化抗体L1-H3及其编码基因与应用。该抗体由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgG1的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。实验结果证实，本发明专利技术抗体具有良好的结合活性和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10-9M。本发明专利技术的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明专利技术制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上所述，本发明专利技术抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗EGFR人源化抗体L1-H3及其编码基因与应用。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidemic growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子基因(erbB)家族的一员，在约30％的人体肿瘤中过度表达，尤其是非小细胞型肺癌、头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌等。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌(80％～100％)，结直肠癌(25％～77％)，非小细胞型肺癌(40％～80％)等有较好的疗效。表皮生长因子受体成为目前研究较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程研制抗EGFR的单克隆抗体，成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。2004、2006年，美国FDA先后批准了针对EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗(cetuximab)和全人抗体帕尼单抗(panitumumab)，用于结直肠癌治疗；2005年，抗EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗(nimotuzumab)获得了我国药监局(SFDA)批准的一类新药证书，目前正在进行II/III期临床试验。鼠源单抗在人体应用中可产生人抗鼠抗体反应，从而影响其功能的发挥。采用基因工程技术改造的鼠-人嵌合抗体可大幅度减弱鼠单抗的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理及ADCC效应，进而增强抗体的生物学效应，但该嵌合抗体结合抗原的能力低于鼠源抗体98.7％。大量临床前及临床试验均已证实西妥昔单抗单药及联合化疗/放疗具有较好的疗效，但简单CDR移植往往会引起抗原抗体亲和力的下降；帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人抗体，与嵌合抗体和人源化抗体相比，人源序列接近100％，大大增强了抗体靶亲和力，但该抗体具有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反应更多等缺点。尼莫珠单抗则通过对抗EGFR鼠源单抗进行人源化改造获得了人源化抗体，并把抗体的轻、重链基因分别连接至不同的表达载体进行表达，由于轻重链表达存在较大差异，往往导致完整抗体分子表达水平极低。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种抗体及其编码基因。本专利技术所提供的抗体，由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgG1的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。上述抗体的重链的氨基酸序列具体可如SEQ ID NO：3所示。上述抗体的轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示：I)其核苷酸序列如SEQ ID NO：2中第85-726位所示或SEQ ID NO：2中第9-729位所示；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；-->III)与I)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子；上述抗体的重链的编码基因为如下1)、2)或3)所示：1)其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒也属于本专利技术的保护范围。上述重组载体具体可为按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表达载体：将所述轻链的编码基因沿着从Nhe I酶切位点至EcoR I酶切位点的方向插在载体pIRES的Nhe I和EcoR I酶切位点间，得到重组载体，记作中间重组载体；将所述重链的编码基因沿着从Xba I酶切位点至Not I酶切位点的方向插在所述中间重组载体的Xba I和Not I酶切位点间，得到的重组载体即为目的重组表达载体。上述重组细胞具体可为将上述重组表达载体导入出发细胞得到的重组细胞；其中，所述出发细胞为293T细胞。制备上述任一所述抗体的方法也属于本专利技术的保护范围。制备上述任一所述抗体的方法可包括如下步骤：培养上述重组细胞，收集上清液，即得到所述抗体。在培养重组细胞的过程中，所述抗体的轻链和抗体的重链分别表达，抗体的轻链和抗体的重链自组装成为所述抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂。本专利技术所提供的抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂。本专利技术所提供的抑抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。本专利技术的另一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤的产品。本专利技术所提供的预防和/或治疗肿瘤的产品，其活性成分为上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒。上述抑制剂或产品中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述抗体、上述编码基因、上述重组载体、上述重组菌、上述重组细胞和/或上述表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述应用中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为SW480细胞。本专利技术的最后一个目的是提供一种蛋白质片段及其编码基因。本专利技术所提供的蛋白质片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-145位所示；-->本专利技术所提供的蛋白质片段的编码基因为如下a)、b)或c)所示：a)其核苷酸序列如SEQ ID NO：4中第1-435位所示；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质片段的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述蛋白质片段的DNA分子。实验结果证实，本专利技术抗体具有良好的抗原结合活性和抑制肿瘤细胞生长迁移侵袭能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10-9M。本专利技术的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本专利技术制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上所述，本专利技术抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。附图说明图1轻链基因、重链可变区基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。图2含有本专利技术抗体的表达载体的结构示意图。图3本专利技术抗体的还原型SDS-PAGE检测。图4本专利技术抗体的免疫印记分析。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pIRES双表达载体购自Clontech公司，产品目录号为631605；pMD18-T表达载体购自Takara Bio Comp本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种抗体，由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中第１－１４５位所示；所述重链恒定区为人源抗体ＩｇＧ１的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗体，由轻链和重链构成，所述重链由重链可变区和重链恒定区连接而成；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中第1-145位所示；所述重链恒定区为人源抗体IgG1的重链恒定区；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。3.权利要求1或2所述抗体的编码基因；或，所述轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示：I)其核苷酸序列如SEQ ID NO：2中第85-726位所示或SEQ ID NO：2中第9-729位所示；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；III)与I)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子；或，所述重链的编码基因为如下1)、2)或3)所示：1)其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链的DNA分子。4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为按照包括如下步骤的方法制备得到的重组表达载体：将所述轻链的编码基因沿着从Nhe I酶切位点至EcoR I酶切位点的方向插在载体pIRES的Nhe I和EcoR I酶切位点间，得到重组载体，记作中间重组载体；将所述重链的编码基因沿着从Xba I酶切位点至Not I酶切位点的方向插在所述中间重组载体的Xba I和Not I酶切位点间，得到的重组载体即为目的重组表达载体。6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞是将权利要求5所述重组表达载体导入出发细胞得到的重组细胞；和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：靳彦文，戴维·威孚，米歇尔·瑞奇韦兹，曹诚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11
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