一种γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株技术

本发明专利技术公开了一种γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株，属于基因工程技术领域。是将谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，从而利用基因工程菌分泌的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸（GABA）。本发明专利技术不仅将谷氨酸的发酵和GABA的转化合二为一，简化了GABA生产步骤；而且以葡萄糖、尿素等为培养原料，相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为前体物质的生物转化方法，生产成本明显降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及Y-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株，属于基因工程

技术介绍
γ-氨基丁酸(Y-Aminobutyric acid，简称 GABA)，由谷氨酸(Glutamic acid, Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,简称GAD)催化脱羧而来。Y -氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质。具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢(醒酒)、改善更年期综合症等多种功效。目前利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力，但是采用该方法生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种Y-氨基丁酸的生产方法，是将谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌分泌的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出Y-氨基丁酸。具体方法如下以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，它具有积累谷氨酸的能力，将谷氨酸脱羧酶基因gadBl导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中构建了重组谷氨酸棒杆菌，使得重组菌利用异源表达的谷氨酸脱羧酶gadBl将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出Y-氨基丁酸。所述谷氨酸脱羧酶基因gadBl来自产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010 年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉、武汉大学，保藏编号 CCTCC NO :M 2010367，分类学命名短乳杆菌 Lb85 (Zacio^ci/^As brevis Lb85)。该菌株是从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选得到的一株产Y-氨基丁酸的乳酸菌，通过镜检和16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种短乳杆菌的 16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为短乳杆菌。所述谷氨酸脱羧酶基因gadBl是根据基因组全序列已公布的短乳杆菌ATCC 367 的谷氨酸脱羧酶基因为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadBl扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO . I0本专利技术还提供了一种GABA的生产菌株，采用本实验室构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8(专利申请号200910233618. 1)，将扩增出的目的基因gadBl连接到载体上，构建出谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW8-gadBl，将重组质粒通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadBl/ATCC13032。发酵液中GABA的精确定量氨基酸自动分析仪法。用5%三氯乙酸将发酵液稀释 25倍后静止30min，12000rpm离心IOmin沉淀蛋白，取上清液，用日立L835-50型氨基酸自动分析仪检测。氨基酸自动分析仪采用2619#树脂(阳离子交换柱f2.6X150mm)，53°C分析，GABA用外标法定量。本专利技术利用重组谷氨酸生产菌，将发酵产生的L-谷氨酸直接转变成γ-氨基丁酸，具有如下优点1)将谷氨酸的发酵和GABA的转化合二为一，简化了GABA生产步骤；2)培养基以葡萄糖作为碳源、尿素等无机氮作为氮源，相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为前体物质的生物转化，生产成本明显降低。附图说明 图1重组质粒pDXW8_gadBl的构建示意图。 具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。材料和试剂所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌 JM109购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。实施例一谷氨酸脱羧酶基因gadBl的获得从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选出一株产Y-氨基丁酸的乳酸菌，通过镜检和16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种短乳杆菌的16SrDNA的同源性为99%， 从而确定该菌株为短乳杆菌。该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉、武汉大学，保藏编号CCTCC NO =M 2010367，分类学命名短乳杆菌 Lb85 {Lactobacillus brevis Lb85)。根据基因组全序列已公布的短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶基因LVIS_1847 为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadBl扩增出来，并进行基因测序。上游引物BlF:5' -CTAGCTAGCAGAAGGAGATATACCATGGCTATGTTGTATGGAAAACAC-3’下游引物BlR: 5， -CCGAAGCTTTTAGTGCGTGAACCCGTATTTTTTA-3’实施例二 重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadBl/ATCC13032的构建 ① 将gadBl与pDXW-8用同样的两种限制性内切酶Nhel、HindIII进行双酶切，分别回收1. 43kb和9. 48kb酶切片段，然后将这两个片段用T4 DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌JM109中完成pDXW8-gadBl重组质粒的构建(图1)；② 将重组质粒pDXW8-gadBl经电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中， 得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadBl/ATCC13032。谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态的制备。将谷氨酸棒杆菌ATCC13032单菌落于液体LBG培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，5g/L葡萄糖)中30°C培养过夜， 随后以10%的接种量转接于30mL感受态培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl, 25g/L甘氨酸，0. 1% Tween-80)中，30°C培养3-釙，之后将菌液置于冰水浴冷却15min，离心弃上清，将细胞悬浮于30mL冰冷的10%甘油中，再次离心弃上清，并用10%甘油重复洗涤2 次，最后用400μ L 10%的冷甘油重悬细胞，分装后于_70°C保存或直接用于电转化。实施例三重组谷氨酸棒杆菌发酵生产GABA培养基种子培养基(葡萄糖2. 5%，尿素0. 6%，玉米浆3. 0%，K2HPO4 · 3H20 0. 15%， MgSO4 · 7H20 0. 05%, pH 7. 0 7. 5)；发酵培养基(葡萄糖16%，尿素0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种γ－氨基丁酸的生产方法，是将谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌分泌的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成γ－氨基丁酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史锋，李佑新，李永富，王小元，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32