本发明专利技术公开了一种阿维菌素产生菌及其制备方法，该菌株保藏名称为FT26-9，保藏编号CGMCC?No.4341，保藏日期2010年11月12日。其制备方法为对出发菌株进行紫外线复合氯化锂诱变处理；诱变株的筛选；亚硝基胍诱变、筛选；硫酸二乙酯诱变、筛选；羟胺诱变、筛选；5-溴尿嘧啶复合紫外线诱变、筛选；最终获得FT26-9菌株，该菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分；其应用于阿维菌素工业生产中可提高发酵单位40％左右，降低生产成本35％左右。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及阿维菌素产生菌及其制备方法，具体地说是阿维菌素产生菌的变异株及其制备方法。
技术介绍
阿维菌素(avermectin，AVM)是一类由除虫链霉菌(str印tomycesavermitilis) 经液体发酵产生的一类大环内酯类抗生素，是一种全新的无公害生物农兽药，其具有高效低毒与环境友好的特点，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效，是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。目前除虫链霉菌发酵产生的阿维菌素中包括有结构类似的 8 种组分(AVMAlaAVMAlb AVMA2a AVMA2b AVMBla AVMBlb AVMB2a AVMB2b)。其中 B 组分的生物活性优于A组分，尤以Bla活性最强。因此如何减低工业发酵产物中的A组分、 提高Bla组分已成为人们研究的重点。例如，天津大学化工学院制药工程系李燕霞等人利用紫外线、亚硝基胍并结合L-异亮氨酸诱变手段对除虫链霉菌进行诱变处理，获得了可显著提高Bla组分产量的菌株，发酵单位比出发菌株提高12. 86% (工业微生物2008年第38 卷第一期)。CN200410009639. 2公开了一种利用紫外线和亚硝基胍诱变筛选得到阿维菌素高产菌株的方法；CN200610149617. 5公开了一株仅产生Bla和B2a的新菌株；但上述技术方案的生产水平仍有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的之一就是要提供一种新的阿维菌素产生菌，以大幅度提高发酵产物中阿维菌素Bla组分。本专利技术的第二个目的就是要提供该菌株的制备方法。本专利技术所提供的阿维菌素产生菌(str印tomyces avermitilis)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏名称为FD6-9，保藏编号CGMCC No. 4341，保藏日期2010年11月12日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)。本专利技术菌株(以下简称FD6-9)是专利技术人通过对阿维链霉菌MF800-6 (以下简称初始出发菌株)经过紫外线复合氯化锂、亚硝基胍、羟胺、5-溴尿嘧啶诱变剂的依次诱变， 然后再对诱变株进行筛选获得。该菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素A组分；其应用于阿维菌素工业生产中可提高发酵单位40%左右，降低生产成本左右。本专利技术菌株的形态学及生理生化学特征如下菌落颜色灰褐色。黑色好氧生长生长。菌体大小/mm :2 6mm。适宜生长温度27.0- . 5°C。适宜生长pH :6. 0-7. 5。菌体外表菌落呈圆形，有褶皱，无光泽，边沿整齐。革兰氏染色阳性。光吸收峰/nm :245nm。本专利技术所提供的阿维菌素产生菌的制备方法，它包括以下步骤a、紫外线复合氯化锂诱变处理(1)孢子悬浮液制备将普通阿维菌素产生菌的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6个/毫升，于波长253. 7nm,进行紫外线诱变；(2)诱变处理将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释为ΙΟ^ΚΓ^ΙΟΛ ΟΛΚΓ5、 10_6、10_7，取0. 1毫升各浓度的稀释液，涂在含氯化锂的平板培养基上，观士0. 5°C培养7-9天。b、诱变株的筛选将诱变后培养的单菌落转接至斜面培养基中，并对应点种到另一培养皿培养基上，培养7天后，取单菌落菌块，用甲醇浸泡18 M小时，震荡后，测定各菌株浸取液的效价，留取10%的高效价菌株，用摇瓶发酵法进行复筛，最终挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株I ；C、亚硝基胍诱变、筛选(1)孢子悬浮液制备在含有磷酸缓冲液的新鲜试管斜面内，将上述出发菌株I的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6个/毫升，过滤，除去大部分菌丝及培养基；(2)诱变处理将上述孢子悬浮液加入亚硝基胍母液，使亚硝基胍含量为1. Omg/ ml，充分混勻后，于观士0. 5°C，220rpm振荡处理40-60分钟；诱变处理完毕后，终止亚硝基胍诱变，分别吸取0. Iml不同浓度的稀释液涂平板，观士0. 5°C培养7-10天；(3)筛选按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株II ；d、硫酸二乙酯诱变、筛选(1)孢子悬浮液制备在含有磷酸缓冲液的新鲜试管斜面内，用上述出发菌株II 的孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6个/毫升，过滤，除去大部分菌丝及培养基；(2)诱变处理将上述孢子悬浮液与硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯含量为！!^/!(^!!^，于观士0. 5°C，震荡处理，诱变处理完毕后，终止硫代硫酸钠诱变；分别吸取 0. Iml不同浓度的稀释液涂平板，观士0. 5°C培养7-10天；(3)筛选按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株III。e、羟胺诱变、筛选(1)孢子悬液的制备取15毫升已灭菌的ph为7. O磷酸缓冲液，倒入一支培养好的III菌株试管斜面内，做成孢子浓度为IO6个/毫升的悬浮液。(2)诱变处理将制备好的孢子悬液进行梯度稀释10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、 10_7，取0. Iml各浓度稀释液，涂在已制备好的含有羟胺的平板上，观士0. 5°C倒置培养7_9天。(3)筛选按照b步方法对诱变株进行筛选，终筛挑选出最后效价高的菌株作为下一诱变剂诱变处理的出发菌株IV ；f、5_溴尿嘧啶复合紫外线诱变、筛选(1)孢子悬浮液制备将出发菌株IV孢子刮下制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6 个/ml，过滤，除去大部分菌丝及培养基；(2)诱变处理孢子悬液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量为1. 0-1. 5mg/ ml，于观士0. 50C，转速220rpm条件下处理5_8小时；将诱变处理过的孢子悬液紫外线照射 35-60 秒。(3)分别吸取处理液进行梯度稀释，吸取0. Iml各浓度稀释液涂平板，在 28士0. 5°C培养 7-9 天。(4)筛选按照b步方法对诱变株进行筛选，最终获得FD6-9菌株。本专利技术方法制备的菌株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B组分，减少阿维菌素 A组分，且其传代稳定好，菌株连续传代15次后，其生长速度、革兰氏染色结果、菌体形态大小、活菌体光谱吸收峰都无明显变化，表明本专利技术菌株完全符合工业化生产菌种需要。本专利技术方法中所用的培养基的配方及制备方法如下单菌落培养基的配方组成及配制(也是阿维菌素常规培养基)。配方(W/V)牛肉膏0. 1-0. 3 %、酵母膏0. 2-0. 5 %、蛋白胨0. 5-1. 0 %、葡萄糖0. 5-0. 8 %、硫酸亚铁0. 001 % (配成0. 1 %母液按比例加入，用时现配)、琼脂粉 2.0-2.5%、余量为蒸馏水。pH 7. 2-7. 5，培养5-8天。单菌落培养基优选的配方为(为便于表述，以下简称1号培养基)牛肉粉(膏)0. 1%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.5%、葡萄糖0.56%、琼脂粉2.5%、硫酸亚铁0. 001%，余量为水。制备方法按照上述配方称取葡萄糖、牛肉粉(膏)、蛋白胨、酵母膏，用蒸馏水溶解并充分混勻，加入硫酸亚铁lmL/100mL (提前配制为0. 1 %的溶液)，用蒸馏水定容至配料体积，用10%的稀盐酸或20%的氢氧化钠溶液调节本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．阿维菌素产生菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ），保藏名称为ＦＴ２６－９，保藏编号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４３４１，保藏日期２０１０年１１月１２日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王琳慧，范令涛，高建辉，
申请(专利权)人：石家庄市兴柏生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：13
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