一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法技术

本发明专利技术申请所述的一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，先将获得潮霉素抗性表达盒克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒，然后利用PCR技术分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒，最后，将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。得到的高效表达的产脂肪酶基因质粒，经转化后得到高表达脂肪酶的基因工程青霉菌，表达高效稳定，较常规的脂肪酶的生产方法具有较大的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术申请涉及一种质粒的构建方法，具体来说，是一种能够高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，属于基因工程

技术介绍
近年来脂肪酶(Lipase EC)在工业应用方面取得了很大进展，碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，它可以水解天然油脂，产生脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。在现有的技术中，通过对大量的微生物菌种进行选育，已经获得了产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P. expansium)菌株，其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常有限，潜力小。
技术实现思路
本专利技术申请即是针对目前在获取脂肪酶的技术中存在的缺乏一种稳定高效的，并且能够在转化青霉菌后高效表达脂肪酶的质粒，本专利技术申请的另一目的是提供该种质粒的构建方法。为了以后的表述方便，下文中提到的“PEL”是指青霉的脂肪酶基因，“PgpdA”是指构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子，“TtrpC”是指构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，PtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子，这些和以下提到的质粒都是基因工程技术中常见的术语，这里不再赘述。具体来说，本专利技术申请所述的，其特征在于所述的构建方法包括下述的步骤1、获得潮霉素抗性表达盒克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；2、利用PCR技术分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子3_磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。所述的步骤1中的潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子(PtrpC)驱动的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因表达盒。所述的构建方法中，目标质粒包括PCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或 pHB。所述的构建方法中，步骤1中，获得潮霉素抗性表达盒的方法包括PCR技术或限制4性酶切技术。所述的构建方法中，步骤2中，获得青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉强启动子 3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的方法包括 PCR扩增、限制酶克隆或化学合成技术克隆。具体的，所述构建方法包括如下的步骤1)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上， 获得潮霉素抗性的重组质粒；2) PCR扩增构巢曲霉强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)后将PgpdA克隆至目标质粒，得到重组质粒；3) PCR扩增脂肪酶基因(PEL)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体；4)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体。进一步的，所述构建方法包括如下步骤1)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒PCAMBIA2300， 获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ；2)PCR扩增强启动子PgpdAJf PgpdA克隆至目标载体，得到含有强启动子的重组质粒；3) PCR扩增PEL和TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，限制性内切酶消化后克隆至PgpdA启动子之后，得到含有PEL基因表达盒的载体 PMD-18-T:PgpdA-PEL-TtrpC ；4)利用限制性内切酶对载体PMD-18-T: PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒PCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体 pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC。更进一步，所述构建方法包括如下步骤1)利用限制性内切酶Mc I, Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒 PCHAMBIA2302 ；2) PCR扩增质粒pAN7_l上的强启动子PgpdA，将PgpdA克隆至PMD-18-T载体，得到重组质粒 PMD-18-T: PgpdA ；3) PCR扩增PEL和TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术将PEL和TtrpC进行连接， 融合片段经凝胶回收，限制性内切酶SpeI和RiieI消化后克隆至PMD_18_T: PgpdA的相应位点，得到含有PEL基因表达盒的载体PMD-18-T: PgpdA-PEL-TtrpC ；4)利用限制性内切酶Ml I，Pme I对载体PMD-18-T: :PgpdA-PEL_TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒PCHAMBIA2302上，获得了含潮霉素筛选标记的 PEL 基因超表达载体 pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC。本专利技术申请所述的构建方法得到的高效表达的产脂肪酶基因质粒，经转化后得到高表达脂肪酶的基因工程青霉菌，表达高效稳定，较常规的脂肪酶的生产方法具有较大的优势。附图说明图1为PV2+载体的结构示意图；图2为pCAMBIA2300载体的结构示意图；图3为pCAMBIA2302载体的结构示意图；图4 为 PMD18-T: :gpdA-Lip-TtrpC 载体的结构示意图；图5 为 pCHAMBIA2302: PgpdA-Lip-TtrpC 最终载体的结构示意图；图6为超表达载体pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图；图7为构建的超表达载体pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；其中，1-6 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Marker ；图8为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱；其中，1-5 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Markero 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术申请所述的本专利技术申请所述的一种高效表达的产脂肪酶基因质粒进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本专利技术的
技术实现思路
，而不是对所述
技术实现思路
的限制，事实上，在本专利技术精神实质内，对本专利技术申请所述高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本专利技术申请所要求保护的技术方案之内。实施例一、超表达载体的构建采用如下的步骤(1)利用限制性内切酶Mc I, Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来(如图1所示)，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒(如图2所示)的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA23本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高效表达的产脂肪酶基因质粒的构建方法，其特征在于：所述的构建方法包括下述的步骤：１）获得潮霉素抗性表达盒克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；２）利用ＰＣＲ技术分别扩增青霉的脂肪酶基因、构巢曲霉３－磷酸甘油醛脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，得到有强启动子驱动的ＰＥＬ基因表达盒；３）将该ＰＥＬ基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的ＰＥＬ基因超表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王剑英，张田，唐可轩，王节亮，
申请(专利权)人：深圳市绿微康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：94