本发明专利技术涉及一种禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的制备方法，即：利用Ｂａｃ－ｔｏ－ＢａｃＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒（ＲＥＶ）囊膜糖蛋白基因（ｅｎｖ）的重组杆状病毒。用ＲＥＶ特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验（ＩＦＡ）和免疫转印试验，均可从感染的Ｓｆ９昆虫细胞中检出ＲＥＶ ｅｎｖ。重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫ＳＰＦ鸡后，可以诱发维持４５天以上的特异性抗ＲＥＶ抗体，并可抵抗ＲＥＶ病毒感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术所涉及的是一种禽用网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，属于兽用生物制品的生产领域。
技术介绍
禽网状内皮组织增殖症(Reticuloendoetheliosis，RE)是由反转录病毒科的禽网状内皮组织增殖症病毒(Reticuloendoetheliosis virus，REV)引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一组综合症，包括致死性网状细胞瘤、矮小综合症以及淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″and reticuloendoheliosis inchickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53457-458；崔治中，等.禽白血病及禽网状内皮增生病感染情况的调查.中国畜禽传染病，1987，(1)37-38)。REV感染后禽生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效果，导致免疫失败。REV已经成为继马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)之后又一重要的禽肿瘤病毒(Jackson C A W，et al.Proventriculitis，″Nakanuke″andreticuloendoheliosis in chickens following vaccination with herpesvirus of turkeys.J Vet，1977，53457-458；Witter R L.Reticuloendotheliosis.InCalnek B W，et al.ed.Disease of Poultry，10thed.USA(Ames)Iowa State University Press，1997，467-484.)。它不但可以引起雏鸡严重的免疫抑制，还严重影响雏鸡的正常发育。如果用被REV污染的鸡胚制备弱毒疫苗，更会污染疫苗。目前，REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率可能高达21.4％～71.0％，其中出现免疫抑制状态的鸡群对REV抗体阳性率要比正常鸡群高的多(崔治中，等.禽白血病及禽网状内皮增生病感染情况的调查.中国畜禽传染病，1987，(1)37-38；崔治中，等.禽网状内皮组织增生病病毒感染和鸡群的免疫抑制.中国兽药杂志，2000，34(1)1-3.)。近年来，国内大量的流行病学调查及病例报告表明，REV感染及其在我国鸡群中造成的危害已相当普遍。REV可在年轻鸡群中引起免疫抑制和生长滞缓(特别是与其它病毒共感染时)，也可引起肿瘤，很多专家已认为近几年我国鸡群中显著增加的肿瘤发病率均与REV感染相关。2001年，金文杰等[9]从传染性法氏囊病的病料中检测到REV的感染率为22.7％；2003年，姜世金等(姜世金，等中.传染性腺胃炎发病鸡中MDV REV CAV共感染的检测.中国兽医杂志，2004，40(4)10-12.)曾用斑点杂交方法对我国800余份发生禽肿瘤的样品进行检测，其中REV的阳性率高达80％以上；2004年，张志等(张志，等.从J亚群白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒.中国兽医学报，2004，24(1)10-13.)从马立克氏病病毒感染的病例中检测到REV的共感染率至少为36.8％。显然，REV的感染应引起人们的重视。REV可以在鸡胚和鸡胚成纤维细胞上复制，但复制量较低，用其做成疫苗免疫鸡后，很难诱发抗体。因此迄今为止，国内外还没有可以用来有效防治REV的疫苗。更没有商品化用于预防REV的疫苗，这一严峻现实对于抗REV疫苗提出了新需求。env基因编码两种糖蛋白gp90和gp20(Tsai W P，et al.Site directed cytotoxic antibodyagainst the C-terminal segment of the surface glycoprotein gp90 of avain reticuloendotheliosisvirus.Virology，1988，166608-611；Tsai W P，et al.，Biosynthesis and chemical and immunologicalcharacterization of avain reticuloendotheliosis virus env gege-encoded proteins.Virology，1986，155567-583.)。其中gp90蛋白是REV病毒的免疫原性蛋白，具有受体结合功能，能够激发感染宿主产生中和抗体，是囊膜糖蛋白的表面蛋白；gp20为穿膜蛋白。本专利技术人试图通过杆状病毒双向表达载体构建REV的env基因真核表达载体，以作为进一步研究抗REV基因工程疫苗的基础。本专利技术的目的本专利技术的目的是通过杆状病毒双向表达载体构建REV的env基因真核表达载体，以制备抗REV基因工程亚单位疫苗。本专利技术的详细描述本专利技术的专利技术要点是利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems，构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒，用重组杆状病毒感染Sf9细胞，经培养，收集细胞，经超声波裂解，制成油乳苗。1表达REV env基因的重组杆状病毒的构建用Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems(CAT.NO.10359-016)杆状病毒表达载体试剂盒构建重组杆状病毒。[Bac to bac杆状病毒表达系统购自Invitrogen公司，主要由转移供体载体pFastBacTMDUAL、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、E.coliDH10BacTM菌株和CellFECTIN转染试剂构成。pFastBacTMDUAL为双向真核表达载体，含有两个强启动子，分别为Polh启动子和p10启动子，能同时高效表达两段外源基因。E.coli DH10BacTM菌株中含有天然杆状病毒全基因组质粒及表达转座酶的辅助质粒(Helper plasmid)。] 详细的操作程序按厂家的说明书进行，现简述如下1.1引物设计和env基因的PCR扩增根据SNV株REV的前病毒基因组DNA测得的全基因序列(GenBank DQ003591)设计一对引物。上游引物5’-CAGGAATTCAAGAATGGACTGTCTCACC-3’；下游引物5’-AGAGTCGACCAAGCATGGGTACAGAAG-3’。其中，上游引物含有EcoRI酶切位点，下游引物含有SalI酶切位点。引物合成后，以SNV株REV的前病毒基因组DNA为模板，PCR扩增包含整个env基因的片段，大小约1.87kb。1.2含REV env基因的重组供体质粒的构建取上文env基因的PCR产物和试剂盒提供的供体质粒pFastBacTMDUAL分别经EcoRI和SalI双酶切，电泳，回收带有EcoRI和SalI粘性末端的env基因和线性化的转移供体质粒。然后将两者以1∶3的摩尔比在T4 DNA连接酶的作用下，16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于预防禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，其特征是：用重组杆状病毒以ＭＯＩ值即感染倍数为２～３的量感染处于对数生长期的Ｓｆ９细胞，３７℃培养４～５ｄ，细胞膨胀变大，并有部分感染细胞悬浮于上清中后，收集细胞，经超声波裂解，以常规法按水相∶油相＝１∶３的比例制成油乳苗，相当于每毫升油乳苗中含有４００万感染的Ｓｆ９细胞。
【技术特征摘要】
1一种用于预防禽网状内皮组织增殖症病毒亚单位疫苗的生产方法，其特征是用重组杆状病毒以MOI值即感染倍数为2～3的量感染处于对数生长期的Sf9细胞，37℃培养4～5d，细胞膨胀变大，并有部分感染细胞悬浮于上清中后，收集细胞，经超声波裂解，以常规法按水相∶油相＝1∶3的比例制成油乳苗，相当于每毫升油乳苗中含有400万感染的Sf9细胞。2按照权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔治中，王锡乐，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]
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