本发明专利技术涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病毒抗体的ＶＰ７３基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。根据ＧｅｎＢａｎｋ中非洲猪瘟病毒（ＡＳＦＶ）ＶＰ７３基因序列，人工合成的ＶＰ７３基因全长序列，构建了重组表达载体ｐＥＴ３２ａ－ＶＰ７３，测序验证后转化原核表达受体菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导表达，重组融合蛋白分子量约６５ＫＤ。经镍柱亲和层析纯化的蛋白能与ＡＳＦＶ阳性血清发生特异性的免疫印迹反应并且与猪瘟、猪细小、猪圆环、猪蓝耳、猪流感和猪伪狂犬等病毒血清无交叉反应。实验表明，表达的蛋白具有检测灵敏度高，特异性强，应用该抗原进行检测时绝无散毒危险，可作为鉴定非洲猪瘟病毒抗体的ＥＬＩＳＡ方法的检测抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病 毒抗体的VP73基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。
技术介绍
非洲猪癌(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。其临床症状主要特征包括高热、 病程短、高死亡率、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能改变等。由于该病高 传染性、高死亡率，给养猪业造成了巨大的经济损失，且野生宿主不可能被根除，因此对该 病的防控面临着巨大挑战。ASF尽管在我国从未发生，但随着国际间交往和进出口贸易的日益频繁，ASF跨边 境传播的风险越来越大，如不引起足够重视，一旦发生该病将导致灾难性后果。由于ASF保 护性免疫反应的复杂性，目前尚无理想的疫苗用于主动或被动免疫，防治上主要采用严格 的诊断和检疫措施，因此建立快速、无感染性的诊断方法对我国十分必要。
技术实现思路
本专利技术提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法目的在于通 过大肠杆菌表达系统表达VP73蛋白，为建立ASFV的ELISA检测方法提供检测抗原。提供 一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高的原核表达检测抗原及其制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现。非洲猪瘟病毒VP73基因片段含有1188个碱基，编码396个氨基酸残基，在用原核 表达载体PET3M进行表达时，VP73基因片段与融合表达载体上的硫氧还蛋白(Trx)得到 融合表达，融合蛋白Trx_VP73的分子量约为65KD。VP73基因片段的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为1ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC1MASGGAFCLIANDGKADKI I61TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT21LAQDLLNSRISNIKNVNKSY121GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC41GKPDPEPTLSQIEETHLVHF181AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT61NAHFKPYVPVGFEYNKVRPH241ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT81TGTPTLGNKLTFGIPQYGDF301TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT 下101FHDMVGHHILGACHSSffQDA361CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC121PIQGTAQMGAHGQLQTFPRN421GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA141GYDffDNQTPLEGAVYTLVDP481TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC161FGRPIVPGTKNAYRNLVYYC541GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG181EYPGERLYENVRFDVNGNSL601GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA201DEYSSDVTTLVRKFCIPGDK661ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT221MTGYKHLVGQEVSVEGTSGP721TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT241LLCNIHDLHKPHQSKPILTD781GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT261ENDTQRTCSHTNPKFLSQHF841CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC281PENSHNIQTAGKQDITPITD901GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT301ATYLDIRRNVHYSCNGPQTP961AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC321KYYQPPLALffIKLRFffFNEN 1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA341VNLAIPSVSIPFGERFITIK 1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA361LASQKDLVNEFPGLFIRQSR 1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG381FIPGRPSRRNIRFKPff 本专利技术提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法，其步骤如1.人工合成VP73基因序列；2.将VP73基因定向克隆至pET3h原核表达载体；3.VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；将重组表达载体pET3h-VP73转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)，进行表达。4.VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括(1)将E. coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以接种量，转接至新鲜 配制的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液体培养基200ml，37°C，250rpm振荡培养。 (2)待其 OD600 达至Ij 0. 8-1. 0，加入 IPTG 至终浓度 0. 2mmol/L,转移至 30°C，250rpm振荡培养4h，12000rpm, 4°C，3min离心收集菌体。(3)将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞 (360W, 30 %，5min重复5次)，4°C，12000rpm离心15min,弃上清，得包涵体沉淀。(4)将包涵体沉淀分别用含 2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea 的 PBS 洗 涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0. 6mol/L NaCl,0. 05mol/L NaH2PO4, IO本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种非洲猪瘟病毒ＶＰ７３基因的原核表达蛋白，其特征是该重组表达蛋白为硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒ＶＰ７３基因编码的融合蛋白，其中非洲猪瘟病毒ＶＰ７３基因的核苷酸序列为：１ ＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＡＴＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣ６１ ＴＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＴ１２１ ＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＣ１８１ ＡＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＡＴ２４１ ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＧＧＡＧＡＣＴＴＴ３０１ ＴＴＣＣＡＴＧＡＴＡＴＧＧＴＣＧＧＡＣＡＣＣＡＴＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴ３６１ ＣＣＴＡＴＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＡＧＡＡＡＣ４２１ ＧＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＣＣＧＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡ４８１ ＴＴＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣ５４１ ＧＡＡＴＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＧＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧ６０１ ＧＡＣＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡ６６１ ＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＡＣＣＴ７２１ ＴＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＧＡＣＣＧＡＴ７８１ ＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＴＴＴ８４１ ＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＡ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：滕达，王建华，李秋霞，杨雅麟，田子罡，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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