一种寡糖纯化分离方法技术

本发明专利技术公开了一种寡糖纯化分离方法。采用亲水作用色谱原理的色谱模式，以极性填料为色谱固定相，制成极性色谱柱，流动相为水、乙腈和缓冲盐，水为强洗脱溶剂，使用等度或梯度洗脱条件。本发明专利技术通过优化缓冲盐类型和浓度，流动相梯度和柱温等参数，实现了对酸性、中性和碱性寡糖的分离与制备。该方法具有稳定性好、上样量大、操作简便可控等特点，适用于不同类型寡糖的分离和纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及寡糖分离与纯化，具体地说是。
技术介绍
糖类是含多羟基的醛或酮类化合物，在生物界中分布广泛。根据分子的构成，糖可 分为单糖、寡糖、多糖、结合糖和衍生糖，其中，寡糖是指由3-9个单糖经糖苷键连接而成的 低度聚合糖。研究表明，寡糖具有各种生物和潜在的药理活性。唾液酸寡糖能刺激血管新生 和抑制肿瘤生 长；母乳中的寡糖可做为受体类似物防止病原体与上皮细胞相互作用，从而保护婴儿 免受细菌、毒素等的侵害；中药地黄中的寡糖具有补血、增强免疫禾口 降血糖等药理活性。深入了解寡糖生物和药理活性的前提是要得到单一的寡糖样品，因此，以获得高 纯度寡糖为目标的寡糖制备技术就成为了寡糖研究中的关键步骤之一。目前，较为常用 的寡糖制备方法包括以下三种尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和薄层色谱法。尺寸排 阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的 色谱技术，多用于生物大分子的分离。Yang等人报道了使用该技术从硫酸皮肤素(DS)中 得到 8 种寡糖 ；Sun 等人则从棉籽木聚糖中得到 了木寡 糖。离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子 和阴离子的一种分离分析方法。它不仅适用于无机离子混合物的分离，也可用于糖类、氨 基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，应用范围较广。该方法被Kelleher等人用于从脊椎动 物组织及酵母细胞中分离制备长醇连接的寡糖。薄层色谱法又称薄层层析，是快速分离物质的一种很重 要的技术，属于固液吸附色谱。该技术也可用于制备复杂样品中的寡糖。尺寸排阻色谱法依据样品分子大小进行分离，选择性相对较差，较难分离具有相 同聚合度的寡糖样品。离子交换色谱依据的是样品所带电荷的差异，在分离带有相同电 荷的寡糖时会遇到一定问题，不易达到基线分离。虽然上述两种方法联用可以在一定程度 上解决选择性的问题，但联用技术无疑增加了实验 步骤，可能会导致样品回收率的降低。而薄层色谱法的操作相对繁琐，溶剂用量大，不易实 现自动化。
技术实现思路
本专利技术涉及。本专利技术使用极性填料做为色谱固定相，分离 模式为亲水作用色谱原理。通过优化流动相梯度条件，寡糖样品有很好的保留，并且达到基 线分离，证明本方法具有高选择性；通过添加缓冲盐，优化其浓度和pH，可以实现中性、碱 性和酸性寡糖的制备，证明本方法具有普适性，适用于不同类型的寡糖制备。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为—种寡糖纯化分离方法，采用亲水作用色谱原理的色谱模式，以极性填料为色谱 固定相，制成极性色谱柱，流动相为水、乙腈和缓冲盐，水为强洗脱溶剂，使用等度或梯度洗 脱条件。所述色谱柱为麦芽糖柱(Click Maltose)、环糊精柱(Click β-CD)、二醇基柱 (Diol)或硅胶柱(Silica)。色谱操作参数如下色谱柱内径为4. 6-50mm ；样品浓度为Img/ mL-lg/mL ；进样量为 1 μ L-IOmL ；流速为 0. 5-150. OmL/min ；柱温为 15-60 0C0所选择缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH如下a.甲酸铵缓冲盐，浓度 5-200mM, pH 2. 8-3. 5 ；b.乙酸铵缓冲盐，浓度 5-200mM, pH 4. 3-5. 0 ；或c.碳酸氢铵缓冲盐，浓度5-200mM，pH 7.9。梯度洗脱时，优化流动相梯度如下按体积比例计，a. A 相为水，B 相为乙腈，O-lOmin，A/B :70/30 — 60/40，10_25min，A/B :60/40 ；b. A 相为甲酸铵，B 相为乙腈，0-30min，A/B :70/30 — 50/50，30_35min，A/B 50/50 ；c. A 相为甲酸铵，B 相为乙腈，0-30min，A/B :70/30 — 50/50，30_40min，A/B 50/50,40-45min,50/50 — 70/30 ；d. A 相为甲酸铵，B 相为乙腈，C 相为水，0-20min，A/B/C 15/70/15 — 15/50/35， 20-30min, A/B/C :15/50/35 ；或e. A 相为甲酸铵，B 相为乙腈，C 相为水，0_30min，A/B/C =20/60/20 — 20/40/40， 30-40min, A/B/C :20/40/40。本专利技术具有如下优点1.高选择性。针对当前寡糖制备遇到的问题，本专利技术提出使用亲水作用色谱方法 制备寡糖。寡糖样品在色谱柱上得到基线分离，有效解决了离子交换色谱和尺寸排阻色谱 选择性不足的问题。2.应用范围广。通过向流动相中添加合适的缓冲盐，优化其浓度和PH值，可以在 同一根色谱柱上实现中性、碱性和酸性寡糖的制备，证明本方法具有普适性，适用于不同类 型寡糖的制备。3.高重复性。实验操作简单可控，易实现自动化，过程稳定，重复性好。附图说明图1为实施例1检测出的样品峰谱图。图2为实施例7检测出的样品峰谱图。具体实施例方式现结合实例，对本专利技术做进一步说明。实例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。具体的制备步骤如下称取适量寡糖固体，配制成浓度为lmg/mL-lg/mL的溶液， 进样量 IyL-IOmL,使用极性色谱柱(Click Maltose、ClickB-CD、Diol、Silica)，色谱柱内 径4. 6-50mm，流速0. 5-150. OmL/min，柱温15_60°C，流动相中添加0_200mM的甲酸铵或乙酸 铵缓冲盐(缓冲盐先用甲酸或乙酸调至合适的PH值)，乙腈为弱洗脱溶剂，等度或梯度条件 洗脱，按时间收集馏分，馏分经氮吹浓缩至ImL左右再使用低温离心浓缩冻干。实施例1半乳寡糖50mg，溶于ImL纯水中，进样量30 μ L。使用麦芽糖色谱柱(ClickMaltose，IOX 100mm，见专利技术专利 200710010808. 8)， 柱温 30°C，流速 3. OmL/min。A 相为水，B 相为乙腈，O-lOmin，A/B(V/V) :70/30 — 60/40， 10-25min, A/B :60/40。柱后分流，分流体积比例5 1，其中约1/6进入检测器，检测器为蒸发光散射 (ELSD)，仪器参数设置气体压力35psi，漂移管温度85°C，增益值1。共检测出6个不同的 样品峰；其为聚合度分别是2、3、4、5、6、7的半乳寡糖；连续进样10次，按6个样品峰的保留时间分别收集馏分，共得到6个馏分，馏分经 氮吹浓缩至ImL左右再使用低温离心浓缩冻干。实施例2半乳寡糖50mg，溶于ImL纯水中，进样量5 μ L。使用二醇基色谱柱(Diol，4. 6 X 150mm)，柱温30°C，流速1. OmL/min。A相为水，B 相为乙腈,O-lOmin，A/B (V/V) :80/20 — 70/30，10_25min，A/B 70/30-60/40 检测器为蒸 发光散射(ELSD)，仪器参数设置气体压力35psi，漂移管温度85°C，增益值10。共检测出 6个不同的样品峰；其为聚合度分别是2、3、4、5、6、7的半乳寡糖。实施例3果寡糖30mg，溶于ImL纯水中，进样量10 μ L。使用麦芽糖色谱柱(ClickMaltose 4. 6 X 100mm，见专利技术专利 2本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种寡糖纯化分离方法，其特征在于：采用亲水作用色谱原理的色谱模式，以极性填料为色谱固定相，制成极性色谱柱，流动相为水、乙腈和缓冲盐，水为强洗脱溶剂，使用等度或梯度洗脱条件。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，傅青，郭志谋，肖远胜，张秀莉，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]