一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法技术

技术编号:5913282 阅读:371 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法,所述方法包括以下步骤:(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7,产生TNFα;(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量;(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。本发明专利技术利用活性状态下的p43具有活化免疫系统的功能性反应以进行p43生物学活性测定,具有特异强、反应快速、重复性好,并能定量反应p43生物学活性的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制品活性检测
,具体涉及一种重组人p43蛋白生物学活 性的检测方法。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌,医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌细胞 为主的方法,即手术治疗、化疗、放疗等。这些方法在杀死癌细胞的同时也损伤正常细胞, 并且容易使肿瘤细胞产生耐药性。因而,人们一直在探索一种能专一性地杀死肿瘤细胞且 不损伤正常细胞,同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方法。目前用于治疗肿瘤的新药不 断涌现。近年来,随着分子生物学技术的快速发展,人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶 性肿瘤的方法。传统的肿瘤化疗大多使用细胞毒性药物,在杀死肿瘤细胞的同时也对正常 细胞造成损害,削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。 恶性肿瘤有一个共同的特性,那就是局部的细胞疯狂地、不受遏制地增殖,而维持这种增殖 就意味着需要大量营养供应。在肿瘤形成的同时,瘤体的内部及周围会形成大量供应养分 的血管。那么如果能切断这些供养“管道”,阻断肿瘤的营养来源,肿瘤也就会衰竭而死。当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底治疗肿瘤带来了曙光。研究发现肿瘤特别 是实体瘤的生长需要大量的营养供应,在肿瘤周围会形成大量的新生血管。抗血管生成疗 法主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长,特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增 殖,从而阻止肿瘤血管生成,使肿瘤毛细血管发生萎缩,切断肿瘤的营养供应,使肿瘤细胞 凋亡或退化到最初的休眠状态,从而达到治疗癌症的目的。经过近十年的不断努力,现在已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血 管抑制剂。其中最具代表性的是人血管内皮抑制素(human endostatin) 0有关人血管内 皮抑制素(Endostatin)国际上首先报道是1997年1月Cell杂志上刊登的美国哈佛医 学院福尔克曼(Folkman)研究小组关于鼠内皮抑素基因的论文,该研究发现Angiostatin 和Endostatin可以消除小鼠体内恶性肿瘤,而且未再复发。这两种药物是以阻止为肿瘤 提供营养的血管的生长从而治疗肿瘤的。当时引起了国际轰动,Endostatin迅速成为肿 瘤治疗领域的研究热点。美国FDA在没有完成临床前研究的情况下特批30例对其它药物 已无反应的晚期癌症病人于99年初用人血管内皮抑制素(Angiostatin)和鼠内皮抑素 (Endostatin)混合基因工程针剂进行临床试验。目前,Endostatin已经通过了 FDA的一期 临床,目前正处于二期临床阶段。但由于Endostatin的溶解性较差,使得它的制备成本升 高,同时在使用上也只能采用水针剂型,这使它的应用受到了很大的限制。p43蛋白是哺乳动物氨酰tRNA合成酶的辅助因子,一方面直接调节内皮细胞形成 毛细血管的生理过程,另一方面P43也受到上游细胞因子的作用而从多种细胞中分泌,进 一步活化巨噬细胞和树突细胞,从而抑制肿瘤生长。P43蛋白的抗血管生成活性及抑制肿瘤 生长作用已经在体外及动物实验获得证实。人基因重组P43蛋白显示出其被开发成新型治 疗癌症药物的潜力,对抗多种原发性和转移性实体肿瘤均有效,并可与化疗和放疗协同治疗。p43蛋白作为人体氨酰tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活肽的 前体于1997年被Sophie Q等人发现。p43蛋白为单链蛋白,全长312个氨基酸。韩国 Imagene公司(W001/95927)对人p43蛋白的结构、生物活性进行了深入的研究,结果显示 人P43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长,以及抑制鸡胚尿囊膜新生血管 生成,这说明P43蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。定性和定量地测定重组人p43蛋白的生物学活性对于该药物的研发具有重要意 义。目前血管生成抑制类药物的生物学活性测定还没有很好的解决办法,现有测定方法的 原理主要建立在该类药物调节血管生成相关生理功能的基础上,具体实验方法包括体外的 内皮细胞迁移试验、内皮细胞增殖试验和体内的鸡胚尿囊膜血管生成试验、小鼠肿瘤抑制 试验、Matrigel试验以及角膜新生血管生成试验。经研究,现有的这些测活方法均存在重 复性较差,人为及实验材料影响因素较大,操作较难控制等问题。因此,目前急需一种能够准确测量重组人p43蛋白生物学活性的方法和产品。
技术实现思路
本专利技术依据活性状态下的p43蛋白具有诱导小鼠单核巨噬细胞RaW64. 7分泌 TNFa的功能,进而通过研究确定重组人p43蛋白与诱导产生TNF α间的量效关系,提供一 种简便、精确、快速定性和定量测定重组人P43蛋白的生物学活性的方法。本专利技术一方面提供了一种测定重组人P43蛋白的生物学活性的方法,本专利技术提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法,所述方法包括以下 步骤(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞RaW64. 7,产生TNFa ;(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFa含量;(3)根据步骤(2)得到的TNFa含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。在本专利技术的一个优选实例中,所述步骤(1)中的诱导方法包括用缓冲液梯度稀释 待测样品,并作出不少于五个稀释度,再将稀释液分别与小鼠单核巨噬细胞混合孵育培养。在本专利技术的一个优选实例中,所述缓冲液是无血清DMEM培养基。在本专利技术的一个优选实例中,所述酶联免疫法是双抗夹心法。在本专利技术的一个优选实例中,所述步骤C3)是根据《中华人民共和国药典》2005年 版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行的。在本专利技术的一个优选实例中,所述步骤(3)如下进行以p43浓度的对数值IgCp43 为X值,以相应的TNFa浓度为Y值,采用Nonlinear regression曲线拟合,得到重组人 P43蛋白的剂量-反应曲线,从而得到四参数分析结果。在本专利技术的一个优选实例中,由所述步骤(3)得到的能诱导50%最大反应的重组 人P43蛋白最高稀释度的倒数作为活性值。本专利技术还提供了一种制备p43蛋白制品的方法,所述方法包括本专利技术所述的测量 重组人P43蛋白的生物学活性的方法。本专利技术利用活性状态下的p43具有活化免疫系统的功能性反应以进行p43生物学 活性测定,具有特异强、反应快速、重复性好,并能定量反应P43生物学活性的优点。附图简述附图说明图1为实施例1中重组人p43蛋白样品促进小鼠单核巨噬细胞Raw264. 7分泌 TNFa的剂量-效应S型曲线。具体实施例方式在本专利技术中,如果没有特别的说明,百分数(% )或者份都指相对于组合物的重量 百分数或者重量份。在本专利技术中,如果没有特别的说明,所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合 形成新的技术方案。在本专利技术中,如果没有特别的说明,本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。在本专利技术中,如果没有特别的说明,本文所提到的所有技术特征以及优选特征可 以相互组合形成新的技术方案。在本专利技术中,如果没有相反的说明,组合物中各组分的含量之和为100%。在本专利技术中,如果没有相反的说明,组合物中各组分的份数之和可以为100重量 份。在本专利技术中,除非有其他说明,数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示,其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法,所述方法包括以下步骤:(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7,产生TNFα;(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量;(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:胡立德刘大涛黄相红谭小钉
申请(专利权)人:上海信谊药厂有限公司
类型:发明
国别省市:31[中国|上海]

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