本发明专利技术涉及一种贯叶金丝桃中金丝桃素提取物的提取方法，一种贯叶金丝桃中金丝桃素提取物的提取方法，包括如下步骤：Ａ．制备金丝桃素硅胶柱层析提取物步骤，又包括如下分步骤：Ａ１准备样品、Ａ２配制洗脱液、Ａ３装柱、Ａ４上样、Ａ５硅胶柱洗脱、Ａ６组分的收集；Ｂ．制备金丝桃素凝胶过滤提取物步骤，又包括如下分步骤：Ｂ１凝胶的预处理与装柱、Ｂ２上样、Ｂ３洗脱及收集，即得到提取物产品。本发明专利技术工艺简单，提取物中金丝桃素含量高，其作为光敏物质，可进行光动力治疗（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ，ＰＤＴ），对人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２、人肺癌细胞系Ａ５４９、ＳｐｃＡ１和人乳腺癌细胞系ＭＤＡ２３１有明显生长抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种金丝桃素提取物的提取方法，特别是指。
技术介绍
贯叶金丝桃(Hypericum performatum L.或St.John’s wort)，又称贯叶连翘，为藤黄科金丝桃属多年生草本植物。中医认为其具有收敛止血及抗菌功效，在欧洲用于治疗抑郁等病症已有悠久的历史。贯叶金丝桃中萘骈二蒽酮类物质金丝桃素具有多种生理活性，在抗病毒方面，可以抑制多种逆转录病毒，包括人体免疫缺陷病毒(HIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、鼠白血病病毒(LP-BM5)和高致病性的禽流感病毒(H5N1和H9N2)等，以及多种包膜病毒，如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、I型单纯疱疹病毒(HSV-1)、流感病毒A1(Brazil)、鼠巨噬细胞病毒(MCMV)和辛德比病毒(Sindbis virus)等；在抗抑郁方面，对于轻度和中度抑郁症患者的疗效明显优于安慰剂，其疗效与三环类抗抑郁药，如丙咪嗪、阿米替林、多虑平等；在抗肿瘤方面，金丝桃素被证明是一种很有潜力的用于光动力治疗肿瘤的光敏剂。体外实验证明金丝桃素对肺癌、胃癌等死亡率极高癌症在内等数十种肿瘤具有PDT治疗潜力，将成为新一代高效无毒的抗肿瘤新药。金丝桃素纯品十分昂贵，应用于临床上，治疗成本高。目前市场上所售的贯叶金丝桃提取物中金丝桃素的含量仅为0.3％，大量的贯叶金丝桃提取物被欧美等国收购后，加工制成高附加值的制剂出售。国内对于从贯叶金丝桃中提取纯化金丝桃素的研究尚处于初级阶段，通常采用醇提取法和碱液提取法，近两年在实验室阶段出现了一些新的方法，如大孔吸附树脂法、超临界CO2萃取法和加压液相色谱柱法(VLC)等。但是，以上这些方法所得的产品只能达到国际市场上要求的金丝桃素含量≥0.3％的基本要求，对于从天然药物中提取纯化生产更高金丝桃素浓度的提取物尚无报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，其工艺简单，且提取得到的提取物中金丝桃素含量高。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案，包括如下步骤A、制备金丝桃素硅胶柱层析提取物步骤，又包括如下分步骤A1、准备样品，将贯叶金丝桃粗提物加入甲醇中溶解，超声波处理20～40min后过滤，再在滤液中加入一定量的柱层析硅胶，混匀后蒸干溶剂；A2、配制洗脱液，采用氯仿-甲醇梯度洗脱剂，洗脱剂极性逐渐增大，氯仿∶甲醇＝9∶1-8.5∶1.5-8∶2-7.5∶2.5(v/v)；A3、装柱，将一定量的柱层析硅胶与氯仿∶甲醇＝9∶1的初始洗脱剂混匀，浸泡8～12小时，在色谱柱下端垫上一层防止漏胶的脱脂棉，缓慢将处理好的硅胶倒入色谱柱，同时不停地敲打色谱柱外侧，使硅胶装实，随着洗脱剂的流出，硅胶不断沉积下来，沉降6～10小时；A4、上样，继续沉降直至溶剂仅够覆盖硅胶表面为止，将处理好的样品缓慢加入色谱柱，随着溶剂的流出，形成一层样品层；A5、硅胶柱洗脱，采用氯仿-甲醇洗脱剂梯度洗脱，洗脱剂极性逐渐增大；A6、组分的收集，将所收集的样品经由TLC检测，合并相同组分，用旋转蒸发仪蒸干，得到金丝桃素硅胶柱层析提取物；B、制备金丝桃素凝胶过滤提取物步骤，又包括如下分步骤B1、凝胶的预处理与装柱，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于60～70％乙醇中6～10小时，洗去可能存在的残留物，湿态不间隙装柱；B2、上样，将金丝桃素硅胶柱层析提取物用甲醇溶解，再经超声波处理后过滤，然后缓慢沿柱壁上样，当溶液缓慢下降至柱内，缓慢加入洗脱液；B3、洗脱及收集，采用甲醇为洗脱剂进行洗脱，将洗脱后的提取物进行收集即得到提取物产品。本专利技术的有益效果是本专利技术的提取方法工艺简单，且提取物中金丝桃素含量高，提取物作为光敏物质，可进行光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)，对人肝癌细胞系HepG2、人肺癌细胞系A549、SpcA1和人乳腺癌细胞系MDA231有明显的生长抑制作用。附图说明图1是本专利技术的流程示意图。具体实施例方式如图1所示，本专利技术提供，包括如下步骤A、制备金丝桃素硅胶柱层析提取物步骤A1、准备样品取1～3重量份贯叶金丝桃粗提物，加入18～22体积份甲醇溶解，超声20～40min，过滤；称取1～3重量份柱层析硅胶(200～300目)，加入上述处理过的贯叶金丝桃提取液，混匀后采用旋转蒸发仪蒸干溶剂。A2、配制洗脱液根据薄层层析(Thin layer chromatography，TLC)优化的结果，本实验采用氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱剂极性逐渐增大，氯仿∶甲醇＝9∶1-8.5∶1.5-8∶2-7.5∶2.5(v/v)。A3、装柱称取20～25重量份柱层析硅胶(200～300目)，以65～75体积份初始流动相(氯仿∶甲醇＝9∶1的洗脱剂)混匀，浸泡8～12小时。在色谱柱下端垫上一层脱脂棉，防止漏胶。缓慢将处理好的硅胶倒入色谱柱，同时不停地敲打色谱柱外侧，使硅胶装实。随着流动相的流出，硅胶不断沉积下来，低流速沉降过夜，测得高径比为3.5～6.5∶1。A4、上样继续沉降直至溶剂仅够覆盖硅胶表面为止，将处理好的样品缓慢地加入色谱柱，随着溶剂的流出，形成一层样品层。A5、硅胶柱洗脱采用氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱剂极性逐渐增大，氯仿∶甲醇＝9∶1-8.5∶1.5-8∶2-7.5∶2.5(v/v)，流速为1.0～6.0mL/min。A6、组分的收集将所收集的样品经由TLC检测，合并相同组分，用旋转蒸发仪蒸干，得到金丝桃素硅胶柱层析提取物。B、制备金丝桃素凝胶过滤提取物步骤B1、凝胶的预处理与装柱将葡聚糖凝胶干粉浸泡于60～70％乙醇中6～10小时，洗去可能存在的残留物，湿态不间隙装柱。B2、上样将金丝桃素硅胶柱层析提取物用甲醇溶解，超声处理，过滤。缓慢沿柱壁上样，当样品溶液缓慢下降至柱内，缓慢加入洗脱液。B3、洗脱及收集采用甲醇为洗脱剂进行洗脱，将洗脱后的提取物进行收集即得到提取物产品。所收集的的产品经TLC检测后，旋转蒸发，以甲醇溶解，超声处理，以HPLC进行定量检测，得到金丝桃素的纯度可以达到2.35％的凝胶过滤提取物。采用本专利技术方法提取的金丝桃素提取物可作为光敏剂用于肿瘤的PDT治疗。以下为本提取物对人肝癌细胞系HepG2、人肺癌细胞系A549、SpcA1和人乳腺癌细胞系MDA231体外生长抑制的药效试验。1、肿瘤细胞系的选择根据发病率高、危害大，传统治疗方法效果不好以及尚无理想的治疗方法为原则选择了人肝癌细胞HepG2、肺癌细胞SpcA1和A549、乳腺癌细胞MDA231作为实验细胞系。2、金丝桃素样品的吸收光谱分析此实验的目的是找出可能用于金丝桃素光动力治疗实验的激发光波长。在400～750nm范围对金丝桃素进行吸收光谱分析，可见金丝桃素最大吸收波长为590nm左右，另外在550nm处也有一较大吸收峰，在620～680nm红光区也有一较小的吸收峰。因此激发光源波长可在这3个范围内选择。3、金丝桃素在避光条件下对细胞的毒性研究此实验的目的在于确定PDT实验中使用的金丝桃素浓度，此浓度在避光条件下应对细胞无明显的毒性，以避免在临床使用时出现毒副作用。各组分别加入一系列不同浓度的金丝桃素，避光培养24h后用MTT法比较各组细胞活力。结果表明，避光条件下金丝桃素对细胞的毒性很小，当金丝桃素浓度达到5μmol/L才出现了较明显的毒性。4、PDT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种贯叶金丝桃中金丝桃素提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：Ａ、制备金丝桃素硅胶柱层析提取物步骤，又包括如下分步骤：Ａ１、准备样品，将贯叶金丝桃粗提物加入甲醇中溶解，超声波处理２０～４０ｍｉｎ后过滤，再在滤液中加入一 定量的柱层析硅胶，混匀后蒸干溶剂；Ａ２、配制洗脱液，采用氯仿－甲醇梯度洗脱剂，洗脱剂极性逐渐增大，氯仿∶甲醇＝９∶１－８．５∶１．５－８∶２－７．５∶２．５（ｖ／ｖ）；Ａ３、装柱，将一定量的柱层析硅胶与氯仿∶甲醇＝９∶１的初 始洗脱剂混匀，浸泡８～１２小时，在色谱柱下端垫上一层防止漏胶的脱脂棉，缓慢将处理好的硅胶倒入色谱柱，同时不停地敲打色谱柱外侧，使硅胶装实，随着洗脱剂的流出，硅胶不断沉积下来，沉降６～１０小时；Ａ４、上样，继续沉降直至溶剂仅够覆盖硅胶 表面为止，将处理好的样品缓慢加入色谱柱，随着溶剂的流出，形成一层样品层；Ａ５、硅胶柱洗脱，采用氯仿－甲醇洗脱剂梯度洗脱，洗脱剂极性逐渐增大；Ａ６、组分的收集，将所收集的样品经由ＴＬＣ检测，合并相同组分，用旋转蒸发仪蒸干，得到 金丝桃素硅胶柱层析提取物；Ｂ、制备金丝桃素凝胶过滤提取物步骤，又包括如下分步骤：Ｂ１、凝胶的预处理与装柱，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于６０～７０％乙醇中６～１０小时，洗去可能存在的残留物，湿态不间隙装柱；Ｂ２、上样，将金丝 桃素硅胶柱层析提取物用甲醇溶解，再经超声波处理后过滤，然后缓慢沿柱壁上样，当溶液缓慢下降至柱内，缓慢加入洗脱液；Ｂ３、洗脱及收集，采用甲醇为洗脱剂进行洗脱，将洗脱后的提取物进行收集即得到提取物产品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张俊松，王晓利，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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