本发明专利技术涉及基因药物领域，具体设计基于基因ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ和ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ的两种治疗结直肠癌的基因药物及制备工艺，和采用该药物进行结直肠癌的治疗，以及增强结直肠癌化疗或放疗疗效的应用。基因ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ和ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ的载体为杂合腺病毒相关病毒（ＡＡＶ），优选为ＡＡＶ７／８。基因药物的剂型为注射剂或冻干粉针，给药途径优选为肌肉注射。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子药物学、分子医学和疾病防治领域，具体涉及基于基因kallistatin和vasostatin的两种治疗结直肠癌的基因药物、制备工艺、以及采用该药物进行结直肠癌的治疗，以及增强结直肠癌化疗或放疗疗效的应用。
技术介绍
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率占全球常见肿瘤的第3位。在欧洲和美国结直肠癌的发病率则排在第2位，仅次于肺癌(男性)和乳癌(女性)。目前结直肠癌的新发病例超过90万/年，死亡病例为50万/年。结直肠癌的发病原因为遗传因素和环境因素的结合。遗传因素约占20％，主要为遗传性易发病，如家族性腺瘤性息肉，遗传性非息肉病性结肠癌，以及其它家族性肿瘤。环境因素约占80％，主要为饮食结构中低纤维，低蔬菜，低叶酸，高脂肪，高牛羊肉；抽烟，喝酒；体力活动缺乏等。尽管结直肠癌可以发生于不同的年龄，产生于不同的原因，但一个特点是共同的即均经过从正常上皮细胞，转化为息肉，再变化为肿瘤细胞的过程。在这个过程中，可以发生一系列遗传基因的变化，如抑癌基因的失活，致癌基因的活化；分子生物学研究发现有p53，Apc和k-ras基因的突变，APC蛋白的变化，微卫星DNA的不稳定，基因杂合性丢失等。遗传性生殖细胞缺陷，或环境因素引起的体细胞的突变，都可以促进结直肠癌的的发展。手术治疗是目前结直肠癌最主要的治疗手段。但结肠直肠癌的手术治疗预后与其所处阶段密切相关。在20世纪80年代，Dukes’A期、Dukes’B期、Dukes’C期的肿瘤病人5年生存率分别为82％、73％、40％。随着诊疗技术上的进步，新的治疗策略使得结肠直肠癌病人的手术治疗后5年生存率均得到了一定的提高，发达国家Dukes’A期提高为90％，Dukes’B期提高为75％。但在国内，由于早期发现、早期诊断率很低，往往确诊后即为肿瘤晚期或已转移，手术治疗的效果非常不理想，术后总体的五年生存率仅在50％-60％。对于肿瘤晚期病人和术后肿瘤转移病人，特别需要其它辅助性手段，在肿瘤细胞长大并危害病人身体之前，将潜在的肿瘤细胞加以彻底消灭。放疗和化疗作为的常规辅助性治疗手段，虽然可以取得明显的效果，但由于其固有的严重不良反应，临床上迫切需要新的结直肠癌治疗药物的开发。肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成，以肿瘤新生血管为靶点的抗血管生成治疗已成为抗肿瘤研究的热点。在众多血管生成抑制因子中，Kallistatin是一新型的具有抗血管生成作用的内源性蛋白(Miao RQ，et al.Blood 2002；1003245-52)，其抗血管生成作用与内皮抑素类似。内皮抑素通过其肝素结合活性介导其对血管生成的抑制作用。各种生长因子必须结合细胞表面两种不同的受体，才能引发一个信号。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受体，在调节多种生长因子的作用时，发挥关键作用。许多生长因子，如VEGF和bFGF是肝素结合生长因子，VEGF和bFGF与内皮细胞表面的HSPGs结合，可以调节它们与专属受体的结合。Kallistatin是肝素结合蛋白，可以与VEGF和bFGF，以及其它含有肝素结合区的生长因子竞争结合HSPGs，因此阻断了这些生长因子与HSPGs的结合，阻断了这些生长因子引发的血管生成事件。另外，kallistatin还是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一员，最初被认为是组织胰激肽原酶结合蛋白。越来越多的证据显示，组织胰激肽原酶在肿瘤相关事件中非常重要，其中包括肿瘤生长调节，血管生成，侵入和转移等。Vasostatin因可以显著抑制内皮细胞的增殖和小鼠肿瘤的生长(Pike SE，et al.J ExpMed 1998；1882349-56)，也是肿瘤抗血管生成的良好候选对象。Kallistatin和vasostatin通过循环系统分布后，可以靶向性作用于肿瘤活化的内皮细胞。因为宿主的大部分内皮细胞处于静息状态，仅在伤口愈合和再生等生理性血管生成过程中，内皮细胞才处于活化状态。肿瘤生成血管的内皮细胞增殖活跃，分化度低，而成人组织的大部分内皮细胞增殖非常迟缓，为高分化表型。因此在循环系统的kallistatin和vasostatin，可以选择性作用于应用肿瘤新生成血管。抗血管生成治疗肿瘤被赋予了极大的希望，但已进行的有关临床实验却未取得预期的效果。其中最关键的原因是瘤体内难以达到有效药物浓度，或不能长时间维持有效药物浓度。基因治疗药物，可以实现目的蛋白在人体内的长期稳定的表达，为解决上述问题提供了思路。AAV(腺相关病毒)作为基因治疗的载体，具有可以同时感染分裂和非分裂细胞，无明显致病性，表达时间长等优点，是非常具备应用前景的载体之一，本课题组在先期的专利申请(CN1836732A)中公开了rAAV(重组腺相关病毒)介导的kallistatin和vasostatin基因药物，其在体内和体外均可以高效表达kallistatin和vasostatin，可以显著抑制肿瘤血管的生成。AAV作为基因治疗的载体，具有可以同时感染分裂和非分裂细胞，无明显致病性，表达时间长等优点，是非常具备应用前景的载体之一，但病毒滴度低，转染效率差等缺点，限制了其进一步的应用。目前已发现多种血清型的AAV，对不同的组织和细胞有不同的感染效率，原因在于不同血清型AAV的衣壳蛋白的差别。对AAV载体的选择和优化，将是提高感染效率的有效手段。对于结直肠癌中晚期病人，肿瘤已侵入黏膜肌层，以及肠壁全层，甚至已经发生了淋巴结转移，现有的治疗方法已经难以有效治疗。迄今，尚无人采用rAAV杂合载体介导kallistatin或vasostatin进行结直肠癌的治疗报导，我们的研究为结直肠癌的治疗提供了新手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供可以治疗结直肠癌的新的基因药物。该基因药物为杂合rAAV载体介导的kallistatin或vasostatin，该载体的基因表达框依次含有AAV2 ITR(invertedterminal repeat sequence)，CMV增强子/鸡β-actin启动子，WPRE(woodchuck hepatitisvirus post-transcriptional regulatory element)，polyA，和AAV2 ITR；含kallistatin或vasostatin cDNA的PCR产物经酶切后，插入上述AAV2载体中，构成rAAV2-kallistatin或rAAV2-vasostatin重组载体，经无辅助病毒多质粒法制备重组病毒，得到基因药物。本专利技术所进行的实验证明，无论在体外还是在体内，本专利技术的基因药物rAAV-kallistatin或rAAV-vasostatin均可以高效表达kallistatin或vasostatin，荷瘤小鼠在应用本专利技术的基因药物后，可以显著地抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长。本专利技术以30余个血管抑制基因为候选对象，通过荷瘤小鼠的体内抑瘤试验，筛选出kallistatin和vasostatin两种基因，对人结肠癌细胞株HCT 116具有明显的抑瘤作用。kallistatin和vasostatin两种基因通过rAAV介导，可以在小鼠体内长期稳定的高表达，从而发挥抑制/治疗肿瘤的效果。本专利技术中所用的AAV皆为重组AAV本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于防治结直肠癌的基因药物，其特征在于：治疗基因为ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ或ａｓｏｓｔａｔｉｎ；基因载体为重组杂合腺病毒相关病毒ｒＡＡＶ，其中杂合腺病毒相关病毒ｒＡＡＶ的衣壳蛋白由两种不同的血清型ＡＡＶ衣壳蛋白组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，冯戬云，朱健华，
申请(专利权)人：许瑞安，冯戬云，朱健华，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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