PUMA在肿瘤放化疗增敏中的新用途制造技术

本发明专利技术涉及ＰＵＭＡ基因的新用途，特别是外源ＰＵＭＡ基因或包含有ＰＵＭＡ　　ＢＨ３结构域的ｃＤＮＡ及蛋白的导入在制备增加肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及PUMA基因的新用途，特别是外源PUMA基因或包含有PUMABH3结构域(LRRMADDLN)的cDNA及蛋白的导入在制备增加肿瘤对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。
技术介绍
肿瘤化疗是恶性肿瘤综合治疗中不可缺少的重要手段，已成为某些肿瘤根治的主要方法，手术后(辅助性化疗)和手术前(新辅助化疗)化疗能使部分癌症的治愈率有所提高，可增加局部晚期多种实体瘤的手术切除机会。但是不同作用机制的各种化疗药物(烷化剂、抗代谢类药物、抗肿瘤抗生素类、抗肿瘤的植物类药物、铂类等)均有不同程度的毒副作用，如骨髓抑制、胃肠道反应、心、肺、肝、肾、膀胱、神经毒性等。放射治疗是除手术和化疗以外的最主要的治疗肿瘤的方法，但它对增殖较慢的或失去增殖能力的组织有较大的毒副作用，如肺放射性纤维化、脑和脊髓的放射性坏死。这些毒副作用严重影响了放、化疗在临床中的应用，寻找一种可以增强放、化疗疗效、减低其治疗剂量，从而减轻其毒副作用的物质是医务工作者孜孜以求的目标。现在，人们已知放疗和大多数化疗药物主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞的。外源促凋亡相关基因的导入有可能起到增加放、化疗敏感性的作用，这在人们以往的对p53的研究中已得到证实。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年报道的新发现的Bcl-2蛋白家族一员，因其可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用而得名。它通过BH3结构域与其它Bcl-2家族蛋白相互作用，诱导细胞色素c释放，引起凋亡。PUMA蛋白定位于线粒体膜上，BH3结构域(141-149位氨基酸，LRRMADDLN)是诱导凋亡所必不可少的，而C端43个氨基酸残基(151-193位)是其在线粒体定位和诱导凋亡所必需的。仅含C端93个氨基酸残基的PUMA表达结构诱导凋亡的水平与全长PUMA蛋白的接近。PUMA诱导凋亡的能力是快速强大的，表达p53的人大肠癌DLD1细胞比表达PUMA的DLD1细胞凋亡形态学改变出现晚9小时(如染色质聚集，核片断化)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PUMA基因或包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白在制备增加放、化疗敏感性药物中的新用途。换言之，本专利技术在于提供一种肿瘤放、化疗增敏剂。本专利技术所述的化疗药物包括，但不限于铂类cDDP(cisplatin顺铂)、CBP(carboplatin卡铂)、L-OHP(Oxaliplatin奥沙利铂)、NDP(Nedaplatin奈达铂)等。微管抑制剂PTX(Taxol紫杉醇)、TXT(Taxotere泰索帝)、VLB(Vinblastine长春碱)、VCR(Vincristione长春新碱)、VNR(Vinorelbine长春瑞宾)等。抗代谢类5-Fu(5-Fluorouracil五氟尿嘧啶)、6-TG(Thioguanine硫鸟嘌呤)、AG337(Nolatrexed洛拉曲克)、FT-207(Tegafur替加氟)、HCFU(Carmofur卡莫氟)、5`-DFUR(Doxifluridine氟铁龙)、UFT(优福定)、Ara-C(Cytarabine阿糖胞苷)等。拓扑异构酶II抑制剂VP16-213(etoposide鬼臼乙叉甙)、VM-26(teniposide鬼臼噻吩甙)等。蒽环类抗肿瘤抗生素ADR(adriamycin阿霉素)、DAM(daunomycin柔红霉素)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、表阿霉素(epirubicin)、去甲柔红霉素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxatrone)等。优选的是顺铂cDDP、紫杉醇taxol、五氟尿嘧啶5-Fu、奥沙利铂Oxaliplatin、鬼臼乙叉甙etoposide、阿霉素adriamycin。本专利技术所述的放射治疗包括但不限于γ射线。本专利技术所述的药物是PUMA基因导入载体或包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白形成的药物。本专利技术可以采用本领域技术人员公知的各种基因导入载体，可以采用腺病毒介导将外源PUMA基因(Ad-PUMA)及缺失BH3结构域的PUMA基因(Ad-ΔBH3)导入的系统，经过体外细胞系、体内人癌裸鼠肿瘤模型，证实Ad-PUMA的协同化疗药物和放射治疗、增强抗肿瘤疗效的作用，而由缺失BH3结构域的PUMA基因构建的Ad-ΔBH3则不具备上述功能。所述的载体并不局限于复制缺陷型腺病毒载体，还可以包括其他各种外源基因导入的方法，如基因枪、脂质体法、受体介导的转导等，以及其它病毒载体系统，所述的其它病毒载体包括，增殖型腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等。成功导入包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白也可起到增加放、化疗敏感性的作用。PUMA或其BH3结构域能增敏的化疗药物也不局限于下面实验中所列举的几种。通常Ad-PUMA的使用包括对于小鼠的治疗实验可根据不同情况(肿瘤大小、治疗次数、间隔时间等)采用不等剂量一般5×108PFU～5×109PFU/次，可每天一次连续给药5次，也可每两天或三天给药一次共三次。本领域技术人员熟知Ad-p53对于人体的治疗用药剂量，治疗组给药剂量、间隔时间不等，按其产品说明书描述为每周一次，每次1012VP(相当于3.3×1010PFU)，瘤组织局部多点注射。本专利技术的Ad-PUMA可参考Ad-p53的使用剂量与用药方式。本专利技术通过一系列体外、体内实验证实导入外源PUMA基因，在多种不同组织类型的包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和食管癌等实体肿瘤中，可增强多种不同作用机制的化疗药物和放射治疗的抗肿瘤作用，外源PUMA基因缺失BH3结构域后则不具备该功能，而且PUMA的导入与化疗药物的协同增效比p53基因的导入更显著。外源PUMA的导入并不改变各种化疗药物本身对肿瘤细胞的细胞周期的影响，这种协同作用是由于诱导凋亡的协同引起的。附图说明图1A显示Ad-PUMA联合放化疗显著抑制A549细胞生长。图1B显示不同剂量的化疗药单独或与Ad-PUMA联合处理A549细胞后的细胞生长率。图2A显示Ad-PUMA显著增强阿霉素诱导的A549细胞凋亡。图2B显示Ad-PUMA显著增强γ射线诱导的A549细胞凋亡。图3显示不同病毒感染食管癌细胞72h后细胞存活率。图4显示KYSE150细胞平板集落形成情况。图5显示不同因素处理48h后KYSE-150细胞周期的变化。图6A显示DAPI染色后的细胞核形态。图6B显示50MOIAd-PUMA感染KYSE150不同时间点凋亡细胞百分比。图6C显示200MOIAd-p53感染KYSE150不同时间点凋亡细胞百分比。图6D显示Ad-PUMA与化疗药联合作用36hr各组凋亡细胞百分比。图7表示采用PUMA的特异性引物(上游5’＞GTCCTCAGCCCTCGCTCT＜3’下游5’＞CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC＜3’)检测PUMA在mRNA水平的改变电泳图。图8显示KYSE150裸鼠移植瘤生长曲线图。图9显示剥离的KYSE150裸鼠移植瘤组织。图10A显示Ad-PUMA显著抑制肺癌细胞生长。图10B显示PI染色法检测Ad-PUMA感染H1299肺癌细胞后细胞的形态改变。图10本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有ＢＨ３结构域的ｃＤＮＡ的ＰＵＭＡ基因及其表达的蛋白在制备增加肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林晨，詹启敏，王海娟，张林，余健，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]