一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，其特征在于所述的制备方法是：将ＰＲＶ－ＦＢ株细胞毒经差速离心后，病毒重悬于ＰＢＳ中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Ｍｅｇａ－１０裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加适当的ＩＳＣＯＭ基质，装袋透析即为ＰＲＶ新型亚单位疫苗。本发明专利技术是以伪狂犬病毒弱毒株（ＰＲＶ－ＦＢ株）为种毒，提取ＰＲＶ－ＦＢ囊膜蛋白为免疫原，应用免疫刺激复合物（ＩＳＣＯＭ）制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，可用于猪伪狂犬病的预防和控制。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法。
技术介绍
伪狂犬病是多种动物共患性传染病，猪是其自然宿主，感染猪康复后呈隐性感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊，初生仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭直至死亡，死亡率几乎100％，断奶仔猪发病率为20％-40％，死亡率为10％-20％，该病已成为目前种猪繁殖障碍综合症的主要病因，并明显呈逐年上升趋势。由于成年猪多为隐性感染，并长期带毒和排毒而成为潜在的传染源，给该病的控制和消灭带来极大的困难。目前世界各国对PR的有效预防主要是疫苗免疫接种，现有的猪伪狂犬病疫苗有油乳剂灭活疫苗及传统的弱毒疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗的不足之处在于如油乳剂灭活疫苗安全性好，但免疫效果不理想，注射局部副作用大，血清学检测不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体；弱毒疫苗免疫效果良好，但不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，且存在毒力返强的危险；基因缺失弱毒疫苗免疫效果良好，并能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，但基因缺失苗可能会因基因重组变为强毒株等潜在的不安全问题。因此，改进现有的疫苗成为各国研究人员攻克的难题，国外已开展了猪伪狂犬病亚单位ISCOM疫苗的研究，其不足之处在于以强毒为制苗种毒，疫苗制备复杂繁琐，疫苗的保存期不明确，限制了疫苗的规模化生产和临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，本专利技术以伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用新型佐剂QuilA和离心透析相结合的免疫刺激复合物制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，研制出的疫苗可用于猪伪狂犬病的预防和控制，并为动物病毒性重大疫病的新型疫苗研究开拓一条新途径。本专利技术所述的疫苗的制备方法是将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加入适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。本专利技术是以伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用免疫刺激复合物(ISCOM)制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，可用于猪伪狂犬病的预防和控制；本专利技术首次在国内外全面系统测定了该疫苗的生物学特性、疫苗的安全性、免疫原性、保存期、抗体持续期、攻毒保护率和最小免疫量等各项免疫学指标。该疫苗主要含囊膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潜伏感染问题，安全性好；同时，优化了囊膜提取技术，简化了生产工艺，ISCOM的应用解决了亚单位疫苗免疫原性差的难题。附图说明图1是PRV囊膜蛋白免疫刺激复合物电镜照片(×10万)复印件。具体实施例方式以下通过试验例来进一步说明本专利技术及本专利技术的有益效果，(但不是对本专利技术的限制)。本专利技术所述的疫苗制备方法是将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加入适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。PRV囊膜蛋白亚单位疫苗不含核酸成份，安全性好，且血清学方法能将自然感染动物和疫苗接种动物区别开，但免疫原性差。为此，本专利技术人进一步采取如下措施，提高其免疫效果(1)上述PRV-FB弱毒的特征与培养是伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)是经乳兔肾原代细胞连续传180代结合蚀斑克隆和低温诱变技术选育出的弱毒株，PRV-FB株对猪、牛、羊等家畜已无致病性；对易感家兔和乳猪盲传五代，无返强现象；接种动物同居接触感染末发现水平传播。上述PRV-FB弱毒株能在如CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145等多种细胞上生长，本专利技术考虑到产业化生产的需要，上述PRV-FB弱毒株选用CEF或Marc-145细胞为病毒培养细胞；PRV-FB病毒的培养是将PRV-FB株种毒接种CEF或Marc-145单层细胞，接种量为培养液量的1％，37℃旋转培养至细胞病变达80％时，收获细胞毒。(2)上述病毒抗原的制备为将PRV-FB细胞毒经-20℃冻融3次，5000rpm离心30-60mins，取上清35000rpm离心90-120mins，取沉淀重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度为10-12mg/ml，即为制苗用病毒抗原。(3)上述Mega-10作用时间和浓度确定是PRV囊膜蛋白的提取，首先需要完全裂解病毒囊膜，影响PRV囊膜蛋白提取的主要因素是Mega-10(华美生物工程公司产品)，因此，筛选最适的Mega-10浓度和作用时间是提取囊膜蛋白的关键。本专利技术用0.01M pH7.2PBS将上述病毒抗原稀释至蛋白浓度为10mg/ml，在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至终浓度为1％～2％，分别于37℃、室温下作用2～5小时，将病毒液铺到蔗糖垫上(蔗糖垫的上层为PBS配制的10％蔗糖，下层为30％蔗糖)，35000rpm(超速离心机，RP40转头)20℃离心90-120mins，收集样品层和10％蔗糖层，装透析袋对0.01M pH7.2PBS透析48小时，收获约3ml即为PRV囊膜蛋白，各取20ul按Bradford法置DyNA Quant200测定仪(Hoefer)测定蛋白浓度(见表1)。结果显示Mega-10对PRV囊膜蛋白的最适作用浓度为2％，作用时间最佳为在37℃条件下3小时，其次为室温条件下4小时。表1不同浓度的Mega-10对PRV囊膜蛋白提取量的影响 注表中数字为囊膜蛋白浓度，单位ug/ml。ND表示未测定。(4)ISCOM基质及QuilA浓度的选择在于PRV-ISCOMs疫苗的免疫原性强弱与囊膜蛋白、ISCOM基质和QuilA的组成密切相关，ISCOM的形成通常通过负染电镜观察见到典型的笼格状结构(图1)来证实。将收集的囊膜蛋白样品层和10％蔗糖层混合后分成A、B、C三组，分别加入含0.05％、0.1％、0.2％QuilA的ISCOM基质，对PBS透析48hrs并经适当浓缩后，取少许电镜检查混合物中的ISCOM颗粒，同时各免疫5只10--12周龄昆明系小白鼠(普通级，购自福建省医科所实验动物中心)，测定血清抗体。结果通过电镜观察和抗体水平测定比较了ISCOM基质中各成份(QuilA、卵磷脂、胆固醇)不同含量的效果，筛选出较佳组合中的QuilA适宜浓度为0.1％。(5)上述新型疫苗的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱(SDS-PAGE)是采用12％分离胶，4％浓缩胶，凝胶厚度1mm电泳系统，标准分子量蛋白为预染的蛋白(sigma产品)。取经适当浓缩的抗原样品与5×样品缓冲液按5∶1混合煮沸3分钟后10000rpm离心5min，取15ul上清上样，电压150V至样品进入分离胶后降为100V，电泳至溴酚蓝指示剂距底部1cm时终止。取出凝胶置于考马斯亮蓝R250染液中室温染色30min，经脱色液脱色后拍照保存，结果见PRV新型疫苗主要蛋白带4条，分子量约为63、50、34、26.5KD。(6)上述新型疫苗的Western blot特征是采用一孔梳加样槽，SDS-PAGE样品为PRV-FB抗原，同上电泳后取出凝胶浸泡在转移缓冲液(25mmol/LTris-HCL、192mmol/L甘氨酸、20％甲醇，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，其特征在于所述的疫苗制备方法是：将ＰＲＶ－ＦＢ株细胞毒经差速离心后，病毒重悬于ＰＢＳ中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Ｍｅｇａ－１０裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加适当的ＩＳＣＯＭ基质，装袋透析即为ＰＲＶ新型亚单位疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，其特征在于所述的疫苗制备方法是将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，病毒重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述PRV-FB株的特征与培养是PRV-FB株是经乳兔肾原代细胞连续传180代结合蚀斑克隆和低温诱变技术选育出的弱毒株，PRV-FB株对猪、牛、羊等家畜已无致病性，对易感家兔和乳猪盲传五代，无返强现象，接种动物同居接触感染末发现水平传播；PRV-FB弱毒株能在CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145多种细胞上生长，所述PRV-FB株选用CEF或Marc-145细胞为病毒培养细胞；PRV-FB病毒的培养是将PRV-FB株种毒接种CEF或Marc-145单层细胞，接种量为培养液量的1％，37℃旋转培养至细胞病变达80％时，收获细胞毒。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述病毒抗原的制备为将PRV-FB细胞毒经-20℃冻融3次，5000rpm离心30-60mins，取上清35000rpm离心90-120mins，取沉淀重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度为10-12mg/ml，即为制苗用病毒抗原。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的Mega-10作用时间和浓度确定是用0.01M pH7.2PBS将上述病毒抗原稀释至蛋白浓度为10mg/ml，在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至终浓度为1％～2％，分别于37℃、室...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少莺，程晓霞，俞伏松，陈仕龙，林天龙，林梅，
申请(专利权)人：陈少莺，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]