一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品和应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的卵黄免疫球蛋白生物制剂和增强免疫功能的卵黄免疫球蛋白保健品。本发明专利技术的目的是通过如下技术方案来实现：一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。应用本技术方案制备出的抗贝氏隐孢子虫病的特异性ＩｇＹ直接作用于贝氏隐孢子虫病症的病原体，发挥特异性抑制作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及到水产动物养殖
，特别涉及到一种防治对贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其应用，此种IgY可以用作防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的生物制剂和增强免疫功能的保健品。
技术介绍
1907年，Tyzzer在小鼠粘膜组织切片首次发现隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)，隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)成为一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。该原虫广泛寄生于哺乳类、禽类、爬行类和两栖类等180种以上的人和动物，可致人类腹泻，尤其是婴幼儿和免疫功能低下或缺陷者致命性的腹泻。引起畜禽腹泻和呼吸道症状，导致生产性能下降或死亡。近年来，对隐孢子虫病研究已成为医学界、兽医学界研究关注的热点。鸡的卵黄免疫球蛋白主要是IgG，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(Yolk Immunobudin G)，简称为IgY。IgY与哺乳动物的IgG在分子结构上相似，但其又具一些特有的生物学特性IgY的Fc区不与人或细菌Fc受体结合，IgY不激活哺乳类动物和人的补体系统，IgY不与人血清中抗哺乳动物抗体的抗体反应，如人的抗IgG抗体，IgY不与葡萄球菌蛋白A(SPA)或链球菌蛋白G(SPG)结合等；由某种特定病原抗原刺激产生的IgY是一种特异性的免疫球蛋白，对该病原具有针对性，从而可以用于特异性治疗，而且因其来源于鸡蛋，没有毒副作用、不存在药物残留、不存在环境污染，此外它的性能稳定，耐热、耐酸碱和高渗环境，便于贮存和加工，对于生产治疗性药物(如口服胶囊)和绿色功能性食品，无疑具有很大的优势。特别对于药物治疗效果不佳，或者没有可用于治疗的病原性疾病，可以用此方法生产IgY生物制剂进行针对治疗。隐孢子虫病目前尚无特效治疗药物，虽然在世界范围内作了大量的药物筛选工作，但到目前为止，仍然没有进入临床应用的文献报道。关于抗隐孢子虫IgY抗体制备方法的研究，国内外罕见报道，本研究通过研制抗贝氏隐孢子虫(C.baileyi)IgY抗体，对制备免疫抗原、设计免疫程序，通过IgY抗体和血清抗体产生的动态规律、抗体应答的持久性，确立了最佳制备方法，为今后制备大量隐孢子虫特异性IgY抗体，或其它弱免疫原性病原特异性IgY抗体提供了最基础的技术。公开号为CN1569229名称为抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用的专利申请，公开了涉及多种具有特异性抗感染功能的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备技术、用于预防龋齿、治疗牙周病及口腔粘膜病、预防及治疗流行性感冒、治疗咽喉炎。公开号为CN1583792名称为一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用的专利申请，公开了涉及到水产动物养殖
，特别涉及到一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其制备方法。其特征是将对虾白斑综合症病毒类的一种或多种灭活毒株/减毒毒株/基因亚单位免疫原/核酸免疫原制成单一抗原或复合抗原，以产蛋禽类作为生物反应器，免疫获得抗对虾白斑综合症特异性IgY，该IgY可单独或与肽聚糖、益生素及中草药组合共同作为饲料添加剂、药用浸浴剂或虾池泼洒剂的活性成分应用于对虾病害防治。本专利技术的效果和益处是该IgY通过被动免疫机制发挥作用，直接抑杀病毒，增强虾体免疫力，在预防和治疗对虾白斑综合症具有效果显著、安全、环保、使用方便等优点。公开号为CN1602720名称为含鸡卵黄免疫球蛋白的蛋粉的生产方法的专利申请，公开了含鸡卵黄免疫球蛋白的蛋粉的生产方法，首先选择含有鸡卵黄免疫球蛋白鸡蛋消毒清洗；将蛋壳和蛋液分离，将收集到的蛋黄、蛋清液搅拌混合均匀制成蛋液，对蛋液过滤除去蛋液中的碎蛋壳及其它杂物；然后，对蛋液采用巴氏杀菌消毒，再采用离心喷雾干燥法或压力喷雾干燥法对蛋液进行干燥，干燥后的蛋粉通过装有每英寸24孔的筛网进行筛分，除去粗大颗粒，再经称量后包装即可。公开号为CN1620886名称为一种预防龋齿的冰淇淋的专利申请，公开了一种用于种预防龋齿的冰淇淋，由雪糕冰淇淋1000重量份、抗龋齿卵黄免疫球蛋白(Igy)0.1-50重量份、抗龋齿卵黄免疫球蛋白稳定剂和冷冻保护剂0.5-35重量份组成；该冰淇淋的制备方法为雪糕冰淇淋配料之后，于冷冻之前，将欲加入的IgY粉先用少量冷开水溶解，然后将稳定剂，保护剂加入混匀并在搅拌运动下呈细流倒入雪糕冰淇淋配料中，充分搅拌均匀，按一般制作雪糕冰淇淋规定的温度和时间冷冻，即得抗龋齿冷饮冰淇淋雪糕；公开号为CN1621090名称为特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途的专利申请，公开了一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及制备方法和用途。该冻干制剂的组份包括特异性免疫球蛋白、赋型剂和溶剂中溶质。其制备方法包括制备特异性病原体抗原；将该特异性病原体抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原；用该免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫；从强化免疫后的产蛋禽类动物所产卵中提取特异性卵黄免疫球蛋白；将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液；将冻干原液经冷冻干燥法制成特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂。本专利技术制备的卵黄免疫球蛋白制剂其特异性卵黄免疫球蛋白不易变性，可保持天然活性，加水溶解即可。该冻干制剂可用在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病的药物或食品、保健品中。公开号为CN1646565名称为用于防治口腔疾病的IgY制备方法以及基于该IgY的牙膏的专利申请，公开了一种用于防治多种口腔疾病的卵黄免疫球蛋白的制备方法，以及以之为主要原料的安全牙膏。在制备IgY时，根据引致龋齿、牙周病、口臭的主要病原体，采用常规方法分别培养出主要的几种致病菌，用所培养的菌种制成复合抗原，然后用所述复合抗原对产蛋家禽(包括鸡、鸭、火鸡等)进行注射，再取家禽所生的免疫蛋的蛋黄制成所需的IgY。利用所述IgY制成牙膏。公开号为CN1201693名称为抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白产品及其应用和活性检测法的专利申请，公开了含有抗体活性的抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗-ARV IgY)的产品，其制备方法采用含A组轮状病毒的抗原皮下注射免疫鸡10天后收集其所产卵的卵黄，通过已知的提取抗-ARV IgY粗品的方法得到粗品，再经下述步骤纯化a.将粗提抗-ARV IgY过DEA E-SephadexA↓[50]凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；b.过SephadexG↓[200]凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗-ARV I gY纯品。公开号为CN1526735名称为一种免疫球蛋白及其制备方法和应用的专利申请，公开了一种免疫球蛋白，采用无特定病原体产蛋母鸡分别进行肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型强化免疫；采用无菌磷酸缓冲液匀化免疫鸡卵卵黄，加入聚乙二醇6000，经离心15～20分钟，收集上清，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，收集沉淀，用无菌磷酸缓冲液溶解沉淀，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，完成脱脂；收集沉淀，进行PEGDEAE-Sephacel柱层析凝胶过滤脱盐、层析，采用磷酸缓冲液洗脱目的蛋白；50％饱和度硫酸铵浓缩目的蛋白；用无菌磷酸缓冲液在4℃～8℃下透析，获得提纯的特异性鸡卵抗体，即所需的免疫球蛋白。其它还有公开号为CN1435260、CN1439281、CN1250056、的专本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。2.根据权利要求1所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，测得卵囊大小为6.5μm ×4.7μm形状指数1.31，经3日龄鹌鹑盲传清除混有的鸡球虫卵囊。3.根据权利要求2所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊，27％(W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊，以3日龄雏鸡传代扩增，经本实验室建立动物感染模型及18sRNA序列比对分析，确定为贝氏隐孢子虫。4.根据权利要求1、3所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于用蔗糖梯度离心法纯化卵囊是指，①配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；②配制PBS缓冲液NaCL 8.0g，KCL0.2g，KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O 2.9g，蒸馏水1000mL，调PH值7.4后灭菌；③将①蔗糖原液与②PBS缓冲液配制为a、1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为30.4称为1∶1蔗糖水；b、1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为25称为1∶2蔗糖水；c、1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为18.7称为1∶3蔗糖水；d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为16.8称为1∶3.5蔗糖水；e、1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为12.5称为1∶5蔗糖水；④卵囊用10 mL直径1.2cm的玻璃离心管提纯，程序如下a、先加入1∶1蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；b、加入1∶2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；c、加入1∶3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；d、加入1∶3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1∶5蔗糖液1份，最上层加入1∶3蔗糖提取物卵囊悬液1份，再沿玻璃管...

【专利技术属性】
技术研发人员：张龙现，邵兆霞，宁长申，菅复春，赵金凤，刘红英，马超峰，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]