用于纯化含咕啉分子的方法技术

本发明专利技术涉及一种亲和吸附剂材料，其包含能够与含咕啉化合物例如钴胺素（ＣｂＩ，或维生素Ｂ↓［１２］）结合的高度－特异性官能团特别是四唑。本发明专利技术还涉及制备这种吸附剂材料的方法，以及在纯化含咕啉分子如钴胺素中的用途。还提供了通过该方法纯化的包含钴胺素的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种亲和性吸附剂材料(affinity adsorbent materials)，其包含能与含咕啉化合物例如钴胺素(CbI，或维生素B12)结合的高度-特异性官能团。本专利技术还涉及制备这种吸附剂材料的方法，以及在纯化含咕啉分子如钴胺素中的用途。还提供了通过该方法纯化的包含钴胺素的组合物。
技术介绍
维生素B12(或钴胺素，CbI)是哺乳动物的两个重要过程中涉及的生物学辅助因子将高半胱氨酸修复为蛋氨酸以及将丙酸转化为琥珀酸盐(1)。所有的哺乳动物均依赖于外源的B12，这是由于其仅仅由微生物进行合成(2)。食草动物从各种寄居在其肠系统的大量细菌中获得CbI。其它动物，包括人类，从动物源如肉、奶和蛋中获得维生素(3，4)。缺乏B12将导致严重的病症，包括神经学上的异常以及贫血(4，5)。CbI是辅助因子中最复杂的分子(图1)，并且包括三个部分1)具有中心钴原子的类咕啉环，2)在较低的轴位置(-位)通过其碱基与钴配位的核苷酸环，3)在较高的轴位置(-位)与钴配位的基团。产生B12微生物同时合成钴胺素及其类似物，该类似物在其结构上与B12不同并且在哺乳动物细胞中不具有催化功能(2，6)。最典型的类似物是具有错误核苷酸碱基的类咕啉(例如假B12，A因子)或者缺失了部分分子(例如钴啉醇酰胺)。钴胺素合成的各种中间产物属于后者。所有的钴胺素和大部分类似物是具有特征吸收光谱的有色物质，这简化了其浓度的测定并使不同的咕啉环(6)彼此区分。具有正确骨架的生物活性的CbI可以包含不同的在-位(图1)上与钴原子配位的上部轴基团。最常见的-基团是甲基、脱氧腺苷、氰化物、水以及一些其它的有机和无机化合物(6)。具有正确骨架的CbI的所有形式(不论其-基团的性质)可以被细胞中的酶转化为具催化活性的辅助因子甲基-或脱氧腺苷-钴胺素(CbI-Met，CbI-Ado)(3)。在这一转化中CbI的中间体形式为含水-CbI(aquo-CbI)(CbI-OH2，维生素B12a)。因此，CbI-OH2、CbI-Ado和CbI-Met是来自任何天然来源的普遍存在的钴胺素(3，4，7)。CbI的氰基形式(CbI-CN)是工业纯的典型产品，并也被称为维生素B12。CbI的制备是已有良好建立的方法，其包含一系列使得活性物质从细菌混悬液中分离的步骤(8，9)。虽然该精确的细节并不为公众所获得，但是其主要的步骤可被假定为1)发酵；2)添加氰化物的细胞的热解作用；3)在基质如木炭上的小有机分子(包括CbI)的非特异性吸附；4)在其它树脂如疏水性吸附剂XAD上的洗脱和吸附；5)用苯酚从水相中洗脱和萃取CbI；6)用水-丙酮混合物从苯酚中萃取CbI；7)干燥；8)溶解在热水中并在室温从丙酮-水溶液中结晶；9)最后的干燥。纯化的产品为CbI-CN(维生素B12)，但是CbI-OH2(维生素B12a)的制备需要其它的化学处理和再纯化。上述过程采用了一系列用来分离的非特异性步骤。相反，也当然可以利用CbI的特有特征，即，在-位与某些化合物配位的能力。例如，具有偶合的-特异性基团的基质可以被用来从溶液中萃取CbI。这意味着技术人员可以仅在一个步骤中从粗萃取物中纯化维生素。成功实施这一方法是值得期待的，这是由于在来源介质中的CbI具有弱结合的轴上部的配基，该配基可以被与吸附剂结合的基团所代替。如上所述，生物源可获得的CbI的主要形式为CbI-Met、CbI-Ado和CbI-OH2。但是，CbI-Met和CbI-Ado的碳-钴键即使在散射光线照明中对光也是敏感性的(6)。其结果是，如果没有采取特别的预防处理，这两种形式在水溶液中均会发生向CbI-OH2的自发性转变。得到的CbI-OH2在其-位具有弱连接的分子(H2O)，该分子可容易地被一系列的化学剂所置换(6，10)。一些已知化合物可以以不同的亲和性与CbI-OH2结合，这导致了CbI吸收光谱的特征性改变。这简化了对制备的复合物的解离常数的测定(6，10)CN-(Kd＜10-12M)，SO3-2＞(Kd＝10-7M)，半胱氨酸的SH-基(Kd＝10-6M)，NO2-(Kd＝10-5M)，N3-(Kd＝10-5M)，咪唑和组氨酸(Kd＝10-4M)，不同的氨基(Kd＝10-3M)，和醋酸盐(Kd＝1M)。但是，这些简单的无机离子在与基质偶合后容易失去CbI-结合的性质。另外，它们中的一些(如含SH化学剂)会导致CbI的开始减少和破坏(6)。早期已经将氨基-琼脂糖树脂用于与有低亲和性的CbI-OH2结合(Nexo1975，Biochim Biophys Acta 379189-192)。但是该结合仅仅在CbI高浓度时才发生并且非常缓慢(16-20小时)。这一方法因而不能被用于从维生素浓度较低的生物源中纯化维生素。因此，存在着对简单并且迅速地从生物和其它来源中分离CbI和其它含咕啉化合物的方法的需要。专利技术概述第一方面，本专利技术提供一种适于纯化含咕啉化合物的吸附剂材料，其中所述吸附剂材料·包含四唑作为官能团，和/或·由包含下述步骤的方法得到i)提供包含氰化物的活化基质，和ii)用包含叠氮化合物的溶液处理所述基质，和/或·具有-特异性官能团，其中所述官能团在pH3～7.5、5℃～60℃下与CbI-OH2结合，其Kd小于100μM，并且其中所述吸附剂材料不引起所述含咕啉化合物的减少和破坏。首次，将吸附剂材料发展为能够以高亲和性在-位与含咕啉化合物结合，而不引起所述含咕啉化合物的减少或破坏。在另一个方面，本专利技术提供了一种制备适于纯化含咕啉化合物的吸附剂材料的方法，该方法包含下述步骤i)提供包含氰化物的活化基质，以及ii)用包含叠氮化合物的溶液处理所述基质。不被一种特定理论所束缚，化学引发的方法以及功能基团的特征指出四唑残基为吸附剂材料中的官能团，即活性物质。在另一个方面，本专利技术涉及用于制备吸附剂材料的方法，其包括使四唑基团与基质相连，或在基质上引发四唑基团的形成。本专利技术还提供了一种用于从溶液中纯化含咕啉化合物的方法，所述方法包含将所述溶液暴露于本专利技术的吸附剂材料。因此，在另一个方面，本专利技术涉及用于从溶液中纯化含咕啉化合物的方法，其包含下述步骤i)提供包含含咕啉化合物的溶液，ii)提供本文定义的本专利技术的吸附剂材料，iii)将所述溶液暴露于所述吸附剂材料中，iv)从没有被吸附到吸附剂材料上的溶液的成分中分离与所述吸附剂材料结合的含咕啉化合物的复合物，v)任选地进行洗涤，以及vi)从所述吸附剂材料中洗脱所述含咕啉化合物。在另一个方面，本专利技术提供了通过本专利技术的方法纯化的钴胺素和组合物，如药物组合物或食品组合物，其包含所述纯化的钴胺素。 附图说明图1.钴胺素的结构。钴胺素(CbI，维生素B12)分子包括三个部分1)具有中心钴原子的类咕啉环，其根据配位的状态而在其原子价方面不同；2)在较低的轴位(α)与碱基配位的核苷酸；3)在上部的轴位(β)与钴配位的基团。不同的基团可以以不同的亲和性在CbI的β-位结合。图2.四唑的形成以及其性质。上图为CNBr-活化的琼脂糖和叠氮化合物之间的反应。建议的方案包含两个步骤，其中在叠氮化合物向氰化物的最初的连接后，随着四唑的出现进行环的转化。在文献11中给出了该反应。下图四唑及其基团在中性p本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于纯化含咕啉化合物的吸附剂材料，其中所述吸附剂材料：.包含四唑作为官能团，和／或.由包含下述步骤的方法得到：ｉ）提供包含氰化物的活化基质，和ｉｉ）用包含叠氮化合物的溶液处理所述基质，和／或　 　.具有［β］－特异性官能团，其中所述官能团在ｐＨ３～７．５、５℃～６０℃与ＣｂＩ－ＯＨ↓［２］结合，其Ｋ↓［ｄ］小于１００μＭ，并且其中所述吸附剂材料不引起所述含咕啉化合物的减少或破坏。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑟吉N费多索夫，托本E彼得森，埃巴奈克索，拉斯E伯格伦德，
申请(专利权)人：科本托公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]