重组FN多肽在制备败血症等严重感染疾病的药物中应用制造技术

本发明专利技术公开了重组纤维连接蛋白Ｎ端肝素结合域多肽和Ｃ端肝素结合域多肽，所述的Ｎ端肝素结合域多肽是由ＦＮ分子中Ｎ端的五个Ｉ型同源结构组成，含有从Ｓｅｒ４６－Ｇｌｙ２８２的２３７个氨基酸；编码该多肽的ＤＮＡ序列从４０３ｂｐ到１１１３ｂｐ，长７１１ｂｐ，ＰＣＲ扩增片断长７４１ｂｐ，双酶切后片断长７２９ｂｐ；由酵母表达的多肽分子量为２８．５２ｋＤａ。所述的Ｃ端肝素结合域多肽是由ＦＮ分子中的三个Ⅲ型同源结构组成，含有从Ｔｙｒ１７２０－Ｔｙｒ１９９１的２７２个氨基酸；编码该多肽的ＤＮＡ序列从５４２８ｂｐ到６２４４ｂｐ，长８１６ｂｐ，ＰＣＲ扩增片断长８３５ｂｐ，双酶切后片断长８２８ｂｐ，由酵母表达的多肽分子量为３６．０９ｋＤａ。在制备败血症严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种医药领域，尤其属于重组FN肝素结合域多肽的制备及其在败血症等严 重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中应用。
技术介绍
纤维连接蛋白，fibionectin ，以下简称FN;重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽， 含237个氨基酸，分子量为29kDa，简称rhFNHN-29，重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多 肽，含272个氨基酸，分子量为36kDa，简称rhFNHC-36;纤维连接蛋白肝素结合域I,即纤 维连接蛋白N端肝素结合域，简称H印I;纤维连接蛋白肝素结合域II，即纤维连接蛋白C端 肝素结合域，简称H印II ; 弥漫性血管内凝血，Disseminated Intravascular Coagulation ,简称DIC; Ampicillin，氨节青霉素，简称Amp;牛血清白蛋白，简称BSA; T载体，简称pGEM-T@ vector; YPD培养基，简称YPD;含甲醇培养基，简称B匿；含甘油 培养基，简称BMGY; Lipopolysaccharide 内毒素脂多糖，简称LPS; D-Galactosamine 半乳糖胺，简称GalN。纤维连结蛋白(FN)是一个多功能的大分子糖蛋白，与细胞的粘连、迁移过程相关， 参与胚胎发生、损伤修复、止血、自主防卫、肿瘤转移等。它广泛存在于细胞外基质、基 底膜及各种体液。体内FN可分血清FN和细胞FN，前者由肝细胞合成和分泌，后者主要由成 纤维细胞合成分泌，其他多种细胞也可合成分泌FN。 FN基因位于2q34，有二个转录变异型的 全序列已经测定完毕，FN1和FN2。 FN基因可在三个位点进行差异剪接，产生近20种不同的 转录本和结构功能相异的蛋白质。FN分子是一个二聚体，其单体亚单位由三种类型(1、 II、 III型)的结构域重复不同 次数构成。其中I型结构域重复出现12个，1I型结构域重复出现2个，III型结构域重复出现 16个。12个I型结构域的氨基酸组成数目36、 39、 44、 45、 45、 31、 39、 38、 39、 45、 42、 41。平均40.33土4.249，其中45个出现三次，39个出现三次。2个II型结构域的氨基酸 组成数均为49个。16个III型结构域的氨基酸组成数目70、 54、 66、 79、 77、 88、 91、 65、 78、 80、 79、 79、 91、 79、 78、 79，平均77.07±9.61，其中79个出现五次，78个出现 二次。败血症(S印sis)和弥漫性血管内凝血(DIC)，是临床常见危重症。败血症尤其由其 产生的感染性休克容易诱发弥漫性血管内凝血(DIC)，而一旦形成弥漫性血管内凝血 (DIC)，又进一步加重休克。由DIC引起的出血危害性极大。DIC也可导致多器官功能衰竭 等严重的并发症，病死率高。血液病患者常表现为感染和血小板减少出血并存的情况。由于感染和出血相互影响， 形成恶性循环，临床上血液病患者内毒素血症和出血的发生率和死亡率都很高。纤维连接蛋白(FN)是细胞外基质的重要成份，为一种具有多种功能的糖蛋白大分 子，能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合，参与细胞的粘附与 迁移、止血过程、损伤修复、在抗感染、维持微血管的完整性等方面具有重要作用，故曾 有调理性a2表面结合蛋白，细胞表面蛋白及细胞粘附因子之称。大量的临床研究表明血浆纤维连接蛋白FN水平对于感染性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)的预后判断 具有重要意义。这些病人血浆FN水平明显而急剧地下降。若给败血症患者补充富含FN的冷 沉淀物(cryoprecipitate)，则在患者血浆FN水平恢复的同时，伴有心肺功能的改善及败血 症的控制，DIC的发生率也明显下降。Barkagan等给106例败血症伴DIC患者输注含FN的冷沉 淀物，取得显著疗效。Brodin B等给26例严重感染住院患者补充冷沉淀物，观察血浆FN水 平及DIC相关指标的变化，结果发现，患者血浆FN水平恢复正常，且无一例发生DIC。提示 FN可用于治疗败血症及DIC。由于从血浆中分离FN将造成血资源的浪费和可能传播血源性传 染病，同时由于FN是一种大分子量的糖蛋白，其分子量高达450kDa，利用基因工程合成整 个FN分子，目前技术上存在着一定的困难。因此本研究在以往成功制备重组PN细胞结合域 多肽(rhFN55)，发现其具有治疗败血症小鼠和DIC大鼠作用的基础上，制备重组FN肝素结 合域多肽，并研究其对败血症小鼠和DIC大鼠的治疗作用。FN分子结构中含有二个与肝素结合的结构域， 一个位于FN的N端，由五个I型的同源结构 组成，该结构域的分子量为29 kDa ，由237个氨基酸组成。另一个位于FN的C端，由第12, 13， 14三个in型的同源结构组成，该结构域的分子量为36 kDa，由272个氨基酸组成。应用 FN分子结构中的肝素结合域多肽研究其对鼠败血症和DIC模型的作用，目前国内外尚未见报 道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出重组FN肝素结合域多肽的制备及其在败血症等严重感染、血小 板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中应用。本专利技术所采用的技术方案是所述的二种重组纤维连接蛋白N和C端肝素结合域多肽， 其一的特征在于是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46Gly282的237个氨 基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到1113bp，长711bp， PCR扩增片断长741 bp，双酶切 后片断长729 bp;由酵母表达的多肽分子量为28. 52 kl)a。所述的另一种重组纤维连接蛋白 C端肝素结合域多肽，其特征在于是由FN分子中的I11-12、 111-13、 III- 14三个III型同 源结构组成，含有从Tyrl720- Tyrl991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从5428bp到 6244bp，长816bp， PCR扩增片断长835 bp，双酶切后片断长828 bp,由酵母表达的多肽分 子量为36.09 kDa。本专利技术的主要内容包括以下几方面-1.重组FN N端肝素结合域和重组FN C端肝素结合域多肽酵母表达载体的构建及多肽的制备根据FNcDNA序列，及与FN分子结构中的氨基酸序列进行比对，确定纤维连接蛋白N端肝 素结合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，结合酵母表达载体的酶切特点，设计 rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR扩增引物和酶切位点。利用所设计和合成的PCR引 物，以FNcDNA为模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。将rhFNHN-29和rhFNHC-36基 因克隆至pGEM-T载体上。将重组的pGEM-T- FNHN-29 (rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细 胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，进行DNA序列测定。正确的克隆进一步 扩增，提取重组pGEM-T -FNHN-29 (rhFNHC-36)质粒。以双酶切和连接的方法将rhFNHN-29 (rhFNHC-36)基因连接到pAo815SM载体中。将重组的pAo815SM- FNHN-29 (rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组纤维连接蛋白Ｎ端肝素结合域多肽和重组纤维连接蛋白Ｃ端肝素结合域多肽在制备败血症严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1、 一种重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽和重组纤维连接蛋白C端肝素结合域...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈元仲，邹起练，吴勇，郭江睿，陈小芳，
申请(专利权)人：福建医科大学附属协和医院，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]