一种蝎毒提取物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种从东亚钳蝎中提取的蝎毒提取物，其制备方法为：取蝎毒冻干粉溶解，离心，０．４５μｍ及０．２２μｍ的微孔滤膜过滤，冻干，葡聚糖凝胶，收集蝎毒Ⅲ－Ⅳ蛋白峰，再进行阳离子交换层析，紫外分光光度仪检测，收集蛋白峰，即为本发明专利技术的蝎毒提取物。经试验证明，本发明专利技术的蝎毒提取物具有确切的抑制新生血管生成作用和抑制肝癌细胞再增值作用。本发明专利技术成功地从东亚钳蝎中提取出了其抑制血管生成和抑制肝癌细胞再增值的有效成分，为以后进一步的研究和应用提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蝎毒提取物及其制备方法，以及在抗血管生成中的应用。
技术介绍
世界上对蝎毒提取物的研究很多，也取得了很多成果，目前已证实蝎毒提取物在临床应 用和基础研究中对多种肿瘤具有确切的抑制作用，蝎毒提取物可通过下调bc1-2表达等机制促 进肿瘤细胞凋亡，及提高机体免疫功能以抗肿瘤。东亚钳蝎作为一传统中药，在临床常用来治疗心血管疾病和类风湿等免疫性疾病，但目 前并不清楚其有效成分，也没有更详细的药理研究，这使其应用与研究受到了很大的限制。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种从东亚钳蝎中提取的蝎毒提取物，并提供了其制 备方法与应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的 一种蝎毒提取物的提取方法，包括以下步骤(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双蒸水=1: 1.5 1: 2，然后5000 6000转/分离心20 30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7. 0 7. 6的蝎毒液，然后5000 6000转/分离心20 30分钟，取上清液11000 13000转/分离心20 30分钟，取上清液。(3) 将上述上清液分别用孔径0.4511111及0.2211111的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻12 36小时，温度一60 —89°C,再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48 72h，收 取冻干粉。(4) SephadexG-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm,收集蝎 毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。(5) 阳离子交换树脂层析层析柱用阳离子交换树脂填充，将经G-50收集的蝎毒III一 IV上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280mn，收集蛋白峰， 操作温度为5'C。(6) 将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度一70°C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥，收集冻干粉。所述蝎为马氏钳蝎，马氏钳蝎又称为东亚钳蝎，多产于山东。 一种蝎毒提取物，是用上述方法制备的。 所述蝎毒提取物在抗血管生成中的应用。 所述蝎毒提取物在抑制肝癌细胞再增值中的应用。本专利技术的蝎毒提取物为从东亚钳蝎中提取的多肽，为含50 60氨基酸的多肽混合物，纯 度89. W，分子量6000 7000道尔顿，耐热，pH稳定，在高效液相色谱显示有4个峰，主峰 占总面积的41.4%。经试验证明，本专利技术的蝎毒提取物具有确切的抑制新生血管生成作用，包括抑制鸡胚尿 囊膜新生血管生成、抑制人脐静脉内皮细胞增殖及抑制肿瘤内新生血管生成。多种疾病存在异常新生血管生成，如类风湿关节炎患者滑膜中血管生成增加，lfiL管增生是 造成滑膜炎,血管翳生长，骨和软骨破坏及骨赘形成的原因。因此抑制新生血管生成,是治疗类 风湿关节炎的新方法；使用本专利技术的蝎毒提取物可有效抑制血管内皮生长因子，从而抑制滑 膜内新生血管生成。肿瘤细胞生长依赖血管提供所需的氧气和营养物质，化疗期间肿瘤细胞 再增殖过程的加速更需要充足的血供，单独使用或在化疗期间联合应用本专利技术的蝎毒提取物， 可有效抑制肿瘤内新生血管生成，若联合应用化疗药物，如制成含有适量药用辅料的口服剂 型或注射剂型，抗肿瘤效果更佳。本专利技术的蝎毒提取物还有确切的抑制肝癌细胞再增值的作用。化疗后残存肿瘤细胞再增 殖过程加速，是肿瘤细胞产生耐药性的重要原因之一，因此抑制肿瘤细胞在化疗间期再增殖 加速对肿瘤治疗有重要意义。实验证实，本专利技术的蝎毒提取物对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。本专利技术成功地从东亚钳蝎中提取出了其抑制血管生成和抑制肝癌细胞再增值的有效成 分，为以后进一步的研究和应用提供了基础。 附图说明图l是蝎毒提取物对人脐静脉内皮细胞的作用示意图2是蝎毒提取物对鸡胚尿囊膜新生血管生成抑制示意图；其中，l为对照组鸡胚尿囊膜， 2为0. 5呢蝎毒提取物干预组，3为0.8mg蝎毒提取物干预组。图3是单独和联合化疗应用蝎毒提取物对肿瘤内新生血管的抑制作用示意图；其中，l为 荷瘤对照组，2为单纯蝎毒提取物干预组，3为蝎毒提取物联合化疗干预组。图4是蝎毒提取物抑制人脐静脉内皮细胞机制示意图；其中，l为对照组bax表达，2为蝎 毒提取物组bax表达，3为对照组bc1-2表达，4为蝎毒提取物组bcl-2表达。图5是蝎毒提取物抑制肿瘤内新生血管的机制示意图，其中，1、 2、 3分别是对照组、单 纯蝎毒提取物组和蝎毒提取物联合化疗组肿瘤组织PDGF表达，4、 5、 6分别是对照组、单纯蝎 毒提取物组和蝎毒提取物联合化疗组肿瘤组织VEGF表达。图6为试验例6中培养三周后各组肿瘤体积示意图7为试验例6中培养三周后各组抑瘤率示意图8为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤中PCNA的表达(X200);其中，3a、 3b、 3c为模型 组第l、 2、 3周；3d为实验组第3周；3e为PESV治疗组第3周；3f为荷瘤对照组第3周。图9为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织PCNA表达的灰度分析；其中，**第2周与模型 组对比，代0.01; A第3周，与模型组对比，代O. 01;图10为试验例6中培养三周后各组vegf表达(X100);其中，6A、 6B、 6C为模型组第1、 2、 3周；6D为实验组第3周；6E为PESV组第3周；6F为荷瘤对照组第3周。图11为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织VEGF表达的灰度分析；其中，*第2周与模型 组对照，代0.05; **第2周与模型组对照，代0.01; A第3周与模型组对照，代0.01; A模型组 与第3周对照，代0.05。图12为试验例6中培养三周后各组PDGF表达(X100);其中，8A、 8B、 8C为模型组第1、 2、 3周；8D为实验组第3周；8E为PESV组第3周；8F为荷瘤对照组第3周.图13为试验例6中培养三周后各组H22肿瘤组织PDGF表达的灰度分析；其中，*3周与模型组 对照，代0.05; **3周与模型组对照，代O.Ol。 具体实施例方式下面结合附图、实施例、试验例对本专利技术作进一步的说明。实施例l:从东亚钳蝎中提取蝎毒提取物，步骤如下(1) 用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双蒸水=1: 2，然后5000转/分离心30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。(2) 将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度lg/40ml、 PH7. 4的蝎毒液，然后5000转/分离 心30分钟，取上清液12000转/分离心30分钟，取上清液。(3) 将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入 冷冻槽冷冻24小时，温度一79。C，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥72h，收取冻干粉。(4) SephadexG-50层析层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导 吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉400mg加PH(PH7.4,0.1M)洗脱36小时，紫外分光光度 仪(吸收波长280nm)检测，收集蝎毒III一IV蛋白峰，操作温度为5'C。(5) 阳离子交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝎毒提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：　（１）用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒∶双蒸水＝１∶１．５～１∶２，然后５０００～６０００转／分离心２０～３０分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉；　（２）将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度１ｇ／４０ｍｌ、ＰＨ７．０～７．６的蝎毒液，然后５０００～６０００转／分离心２０～３０分钟，取上清液１１０００～１３０００转／分离心２０～３０分钟，取上清液；　（３）将上述上清液分别用孔径０．４５ｕｍ及０．２２ｕｍ的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入冷冻槽冷冻１２～３６小时，温度－６０～－８９℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥４８～７２ｈ，收取冻干粉；　（４）Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０层析：层析柱用葡聚糖凝胶Ｇ－５０填充，小牛血清５０ｍｇ／２０ｍｌ前导吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长２８０ｎｍ，收集蝎毒Ⅲ－Ⅳ蛋白峰，操作温度为５℃；　（５）阳离子交换树脂层析：层析柱用阳离子交换树脂填充，将经Ｇ－５０收集的蝎毒Ⅲ－Ⅳ上柱，流速０．５ｍｌ／分钟，梯度洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长２８０ｎｍ，收集蛋白峰，操作温度为５℃；　（６）将步骤（５）中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻２４小时温度－７０℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥，收集冻干粉。...

【技术特征摘要】
1.一种蝎毒提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒双蒸水＝11.5～12，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉；(2)将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度1g/40ml、PH7.0～7.6的蝎毒液，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，取上清液11000～13000转/分离心20～30分钟，取上清液；(3)将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入冷冻槽冷冻12～36小时，温度—60～—89℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48～72h，收取冻干粉；(4)Sephadex G-50层析层析柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维东，贾青，张月英，王兆朋，王朝霞，王燕，
申请(专利权)人：山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]