一种疟疾免疫层析快速检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种疟疾免疫层析快速检测试纸条及制备方法，所述试纸条由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白ＩＩ单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被与标记垫上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白ＩＩ单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区包被抗鼠ＩＧｇ单克隆抗体。本发明专利技术的试纸条提高了在疟疾筛查的准确性和便捷性；操作简便，具有快速、简便、直观的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，具体地说，本专利技术涉及一种恶性疟(P. f)和非恶性疟 (P. V、P. O、P. m)快速联测的免疫层析检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
疟疾(Malaria)是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，寄生于人体的疟原虫有 四种恶性疟原虫(Plasmodium falcipar μ m)、间日疟原虫(Plasmodi μ m vivax)、三日 疟原虫(Plasmodiym malariae)和卵形疟原虫(Plasmodiym ovale)。我国以前二种为 常见。血检疟原虫迄今仍是确诊疟疾最可靠的方法，此法能鉴别虫种和虫期，但耗时、费力， 需要熟练的技术人员和一定的实验室条件。对于疟疾的实验室诊断主要是依靠病毒分离培 养，虫体形态学观察、PCR和免疫学方法ELISA进行鉴定。虽然灵敏度高，但是需要时间长， 往往不便于现场检测。因此，寻找快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是当今疟疾防治工作 中迫切需要解决的问题之一。免疫层析技术在疟疾诊断中的运用主要是检测3种靶抗原富组氨酸蛋白 (HRP-II)、疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)和疟原虫谷氨酸脱氢酶(ρ⑶H)。(I)HRP-II是恶性疟 原虫消化血红蛋白后形成的代谢产物，由血液期无性体和早期配子体合成，含有大量组氨 酸，具有种特异性，由于是水溶性抗原其可在疟疾患者的血浆、尿、全血中检测到，是诊断恶 性疟的理想靶抗原。0)pLDH是疟原虫体内代谢酶，红内期疟原虫无性期和配子体期均有 表达，其物理生化、免疫学特性、酶催化作用等与人体红细胞和其他许多微生物的乳酸脱氢 酶(LDH)差异性大，疟原虫LDH具有种属特异性，可以作为免疫诊断的靶抗原。研究表明， 只有活虫体才可以产生LDH，血液pLDH水平与原虫血症平行，且LDH活性与活虫密度消长 呈平行改变，因此通过检测PLDH可监测药物疗效以及复燃情况。疟原虫LDH，在疟原虫的 整个红内期均表达，在疟原虫能量代谢中发挥重要作用。早期的研究揭示了在各种疟原虫 LDH之间不但具有共同抗原表位，还具有特异性抗原表位，因而能同时鉴别诊断恶性疟和非 恶性；另外LDH仅由活体虫产生，因此可用于鉴别疟原虫的死活，监测治疗效果和复燃的情 况，是理想的疟疾免疫诊断试剂的靶抗原。目前，国际、国内在本
的现有技术有利用双抗体夹心法疟疾(Malaria) 的胶体金快速诊断试剂，如艾康公司的恶性疟\间日疟免疫层析检测试纸条，该试纸条 可以检测恶性疟及间日疟，通过排除法检测虫种，但是不能鉴别混合感染和鉴别虫期。 MALAR-check公司的疟疾免疫试纸条基于免疫层析原理，利用双抗体夹心法检测血液标本 中恶性疟原虫在血液无性期和配子体早起分泌的富组氨酸蛋白。其检测的敏感性和特异性 与PARASHGHT-F法相近。此检测可提高常规镜检测诊断不能区别的混合感染的早起滋养体 期。另有现有技术中有产品采用检测恶性疟原虫HRP-II的双抗体夹心法，以重组的 恶性疟原虫HRP-II诊断抗原为靶点，制备相应的单克隆抗体检测恶性疟。其缺陷均是无法 进行恶性疟和非恶性疟的联检。目前以纳米胶体金为标记物的免疫层析技术发展很成熟，但其在灵敏度和稳定性方面比Elisa法或者PCR法有一定的差距，且胶体金标记制备工艺 复杂，成本较高。且由于胶体金只能显示红色，不能多样式的显示检测结果，特别是对于多 项目联检的试纸条来说，不易区分检测线和质控线，对于检测结果容易造成判断失误。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种疟疾免疫层析快速检测试纸 条，该试纸条可以进行恶性疟和非恶性虐的联检，具有快速、简便、灵敏、操作方便的优点。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案一种疟疾免疫层析快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫、标记垫、包被膜、吸水 纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，所述标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组 氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，包被膜包括检测区和控 制区，所述检测区包被与标记垫上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白 II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区包被抗鼠IGg单克隆抗 体。优选地，所述标记垫上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒 的比例为1 5 1 30，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比 例为1 5 1 30。优选地，所述彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非 恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5 15μ g/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数 为 20cm2/ml 30cm2/ml。优选地，所述包被膜上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和所述非恶性疟 原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度均为1. 5mg/ml 2. Omg/ml ；所述抗 鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为1. Omg/ml 2. Omg/ml。优选地，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓 度为1.7mg/ml ；所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为 2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为2. Omg/ml。优选地，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢 酶单克隆抗体在检测区的包被用量均为0. ομ 1/mm 0. 25 μ 1/mm ；所述抗鼠IgG单克隆 抗体在控制区的包被用量为0. 10 μ 1/mm 0. 30 μ 1/mm。本专利技术还提供了上述疟疾免疫层析快速检测试纸条的制备方法，采取了以下技术 方案一种制备疟疾免疫层析快速检测试纸条的方法，包括以下步骤A.按常规方法纯化恶性疟原虫富组氨酸蛋白II和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克 隆抗体的生产菌株；B.筛选制备多株富组氨酸蛋白II和疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体；按常规方 法，经过筛选配对筛选合适的两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株非恶性 疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株 非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体分别处于不同的表位；C.彩色胶乳标记单克隆抗体采用彩色胶乳标记一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫 乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳 酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5 15μ g/ml，按稀释参数为20cm7ml 30Cm2/ml，将所 述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体喷点标 记垫上，然后将标记垫烘干，密封；D.将另一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶 单克隆抗体均稀释至1. 5mg/ml 2. Omg/ml，按0. 10μ 1/mm 0. 25 μ 1/mm的包被用量分别 包被至包被膜的检测区的Tl线和T2线；将抗鼠IgG单克隆抗体稀释至1. Omg/ml 2. Omg/ ml，按0. 10 μ 1/mm 0. 30 μ 1/mm的包被用量包被至包被膜的控制区；E.将样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸顺次粘贴在底衬上，即得。优选地，所述包被膜上Tl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疟疾免疫层析快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫（２）、标记垫（３）、包被膜（４）、吸水纸（５）顺次搭接粘贴在底衬（１）上构成，其特征在于，所述标记垫（３）上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述包被膜（４）包括检测区（６）和控制区（７），所述检测区（６）包被与标记垫（３）上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区（７）包被抗鼠ＩＧｇ单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王继华，李国存，
申请(专利权)人：广州万孚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81