参与红薯中类胡萝卜素累积的ＩｂＯｒａｎｇｅ基因制造技术

本发明专利技术涉及来自红薯的与类胡萝卜素累积有关的ＩｂＯｒａｎｇｅ蛋白、编码该蛋白的基因、含有该基因的重组载体、用重组载体转化的宿主细胞和用于扩增ＩｂＯｒａｎｇｅ基因的引物对。根据本发明专利技术，通过ＩｂＯｒａｎｇｅ基因增加类胡萝卜素的产量，预期可以培育出既具有改善的功能活性，又对环境应力具有强抵抗力的作物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及源自含有大量类胡萝卜素的“Shinwhangmi”甘薯的Orange基因。更 具体地，本专利技术涉及通过控制基因表达能够提高类胡萝卜素产量的蛋白质，其是通过控制 与类胡萝卜素的生物合成有关并且参与成色素细胞中的类胡萝卜素累积的基因以及编码 所述蛋白质的基因完成的。
技术介绍
甘薯(Ipomoea batatas L. Lam)为一种能够在相对贫瘠的土壤中种植的块根作 物，其每公顷的产量高达约30吨。因此，其通常作为人类食用的食物和牲畜的饲料。特别 地，在干物质中大约70%为淀粉，甘薯早已被用于获取醇的原材料，现在也是被认为作为是 一种环保型的作物，其可作为一种替代能源而使用，即用于生产生物乙醇。由于近年急剧的工业化和人口增长，世界各地的环境和粮食问题尤为突出。因 此，目前人们正在积极开发能够抵抗荒漠区、污染区或寒冷区等等的极端环境条件的农业 作物。特别地，为了开发具有产业优势并可在上述恶劣环境区域中种植的甘薯，目前人们正 基于分子培育方法，开发具有抵抗恶劣条件的环境的转基因甘薯(Limet al.Mol Breeding 19，227-239，2007)。根据世界卫生组织(WHO)的报道，有超过十亿的儿童患有维生素A缺乏症，由此造 成每年超过50万儿童失明。胡萝卜素是维生素A的前体化合物。鉴于胡萝卜素具 有的作为营养加强剂和食物援助的生理活性，关于食品中类胡萝卜素的积累代谢研究对于 提高其营养价值是一个重要的研究课题。胡萝卜素被认为是具有较高抗氧化活性的物 质，不仅因为其生理活性，而且因为其在植物自身在对抗氧化应激的防御机制中起到的关 键作用。最近，人们发现，类胡萝卜素的生物合成受一种植物激素ABA的影响。因此，有必 要进一步研究以确定这些抗氧化物质和环境压力间的关系。同时，康奈尔大学(美国)的Lu等人报告指出突变Orange基因与菜花的成色素 细胞中的类胡萝卜素的累积有关(Lu S等，2006 Plant Cell. 18 :3594-3605,2006) 专利技术详述技术问题本专利技术系针对上述需要而设计。本专利技术的专利技术人从具有高含量的类胡萝卜素的 “arinwhangmi”甘薯中克隆了 Orange基因。因此，在对大肠杆菌中的重组蛋白的生成进行 确认之后，本专利技术得以完成。技术方案为了解决上述问题，本专利技术提供了来源于甘薯的与类胡萝卜素累积相关的 IbOrange 蛋白。进一步地，本专利技术提供编码rtOrange蛋白质的基因。进一步地，本专利技术提供包含rtOrange基因的重组载体。进一步地，本专利技术提供用所述重组载体转化的宿主细胞。更进一步地，本专利技术提供为rtOrange基因的扩增设计的引物对。专利技术效果根据本专利技术，能够确定的是Orange蛋白质的表达和源于“Shinwhangmi”甘薯的 Orange基因由诸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水杨酸等与植物干旱应激和防御机制有关的 植物激素诱导。因此，可以预期的是，通过由H3Orange基因提高类胡萝卜素的含量，能够开 发出不仅具有改进功能而且对环境压力具有抵抗力的植物。附图说明图1表示源自甘薯(“Shinwhangmi ”)的Orange基因的核苷酸序列和由此推测出 的氨基酸序列。下划线区域表示质粒定位信号，由942bp组成的cDNA编码由313个氨基酸 组成的蛋白质。图2表示由本专利技术的甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange基因推测出orange蛋 白质的氨基酸序列，其中也记载来自其它各种植物的氨基酸序列用于比对(牵牛花、番茄、 葡萄、黄豆、大豆、棉花、拟南芥、花椰菜、高粱、玉米、水稻和大麦)。图3表示由本专利技术的甘薯(Ipomoea batatas)的BOrange推断的氨基酸序列和 来自其它各种植物(牵牛花、番茄、葡萄、黄豆、大豆、棉花、拟南芥、花椰菜、高粱、玉米、水 稻和大麦)的Orange基因间的基因相似性关联。图4表示由RT-PCR测定的本专利技术的rtOrange基因的表达类型以及各种种类 的甘薯的电泳。在该图中，分别地，Ym表示“Yoolmi”，Jm表示“Shinjami ”并且Hm表示 “Shinwhangmi”。图5表示由RT-PCR测定的本专利技术的rtOrange基因的表达类型以及甘薯的各部分 的电泳。特别地，L表示叶子，S表示茎，其它包括贮藏根、须根以及厚的色素根。图6表示由RT-PCR测定的本专利技术的rtOrange基因的表达类型以及用植物激素 (诸如ABA、乙烯磷(即乙炔的前体)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA))处理的甘薯的叶 和根的电泳并且在处理后的0、12、24、36或48小时进行RT-PCR。图7表示该蛋白质的电泳结果，其表明，泳道1，在大肠杆菌中的rtOrange的重组 蛋白的产生；泳道2，具有His-tag的可溶的^Orange ；泳道3，具有His-tag的不可溶的 IbOrange ；以及泳道4，具有GST-tag的不可溶的IbOrange。本专利技术的最佳实施方式为实现上述本专利技术的目的，本专利技术提供源自甘薯(Ipomoea batatas)的^Orange 蛋白质，其与类胡萝卜素累积相关。本专利技术H3Orange蛋白质的范围包括，从“Shinwhangmi”甘薯中分离的具有SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的蛋白质以及所述蛋白质的功能等价物。术语“功能等价物” 指的是，氨基酸残基添加、取代或缺失的产物，其具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列的至少 70%、优选地至少80%、更优选地至少90%、更为优选地至少95%的同源性的氨基酸序列， 因此表现为具有与SEQ ID NO :2所示的蛋白质基本上相同生理活性的蛋白质。进一步地，本专利技术提供编码上述rtOrange蛋白质的基因。本专利技术的基因包括编码 rtOrange蛋白质的基因组DNA和cNDA。优选地，本专利技术的基因可以包含由SEQ ID N0:1所 表示的核苷酸序列。另外，鉴于rtOrange基因对应于多基因家族并且具有包含在甘薯中的各种同源基因，本专利技术的H3Orange基因不仅可以包括具有SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序 列的rtOrange基因也包括BOrange基因的多基因家族。进一步地，本专利技术的范围也包括该核苷酸序列的突变体。特别地，上述基因可以含 有具有与SEQ ID NO :1的核苷酸序列的至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%、更 为优选地至少95%的同源性的核苷酸序列。所述针对特定的聚核苷酸的“序列同源性％” 通过比较对齐的两个序列的比较区域来确定。鉴于此，在比较区域中的部分聚核苷酸可以 包含相比于与所述两个序列的最优比对相关的参考序列(没有任何添加或缺失)的添加或 缺失(即间隔)。本专利技术的全长^Orange cDNA有942bp组成且其编码313个氨基酸残基(见图 1)。依据氨基酸序列计算，等电点(Pl)和分子量(Mw)分别为8.46*34.4kDa。采用基因 BLAST分析，发现其携带有包含重复半胱氨酸残基的CxxCxGxG的重复基序，该重复基序在 其它公知为DnaJ蛋白的orange蛋白质中被很好地保留，其为一种分子伴侣。可以确定的是本专利技术的^Orange基因在包括Yulmi (灰白色甘薯),本文档来自技高网...

【技术保护点】
来自甘薯（红薯）的ＩｂＯｒａｎｇｅ蛋白，其中所述蛋白由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭尚洙，李幸顺，安荣玉，金且英，金善荷，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR[]