提供用于制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，包括用缺失盒转化粟酒裂殖酵母，该缺失盒由４轮连续ＰＣＲ、阻断ＰＣＲ或全基因合成构建，含有同源重组位点。还提供了由该方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体文库。此外，该文库在构建用于筛选药物作用方式的方法和试剂盒中有用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉 及系统地制备基因靶向的杂合缺失突变粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)菌株的方法。更具体地，本专利技术涉及通过用缺失盒(deletion cassette)转化粟酒裂殖酵母制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，该缺失盒由4 轮连续PCR、阻断PCR或全基因合成构建，含有同源重组位点。同时，本专利技术涉及由该 方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖 酵母突变体的文库。此外，本专利技术与用于在文库中筛选药物作用方式的方法和试剂盒有 关。
技术介绍
在2006年，据报道全世界的药物市场价值为6430亿美元，韩国药物产品占该总 额中的11,4728亿韩元份额。全球药物市场预期在2007年增加到7350 7450亿美元。 据报道将新药带进市场需要1 6亿美元的平均成本，10至15年的开发期。尽管这样巨 大的时间和金钱的花费，但是据报道新药开发的成功率低，为万分之一。因此，新药的 成功开发必须应该从许多可能的作用方式中定义高度假定的在疾病的发生和治疗中起关 键作用的“药物的作用方式”；这通常是通过从复杂的实验数据中提取生物相关性的智 能生物信息学工具完成的。由此，系统地筛选直接涉及许多疾病的特异作用方式非常重 要。就这一点而论，筛选技术在鉴别药物发挥其治疗作用的靶标中是有用的，因此 非常有助于减少药物开发需要的时限。同时，筛选技术允许与药物的副作用相关的作用 方式的鉴别。因此，急需筛选药物作用方式的新颖的方法。粟酒裂殖酵母是本专利技术的优选实施方式中有用的裂殖酵母，它与芽殖酵母—— 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在进化上不具有高度相关性，尽管它们都属于子囊 菌粟酒裂殖酵母(ascomycetes S.pombe) (Wood V.et al.，Nature.45 871-880，2002)， 在酿酒酵母以后被标记为第六模式真核生物，其基因组已被完全测序(Goffeau A.etal.， Science, 274 546-567，1996)。根据分析，在迄今其基因组已被测定的真核细胞中， 粟酒裂殖酵母具有有效的基因组结构，该结构具有最低的基因功能重复。还据报道粟酒 裂殖酵母含有4,824个蛋白编码基因，这是已被鉴定的真核生物的最小数目，但是约43% 的基因含有内含子。同时，发现粟酒裂殖酵母具有对包括细胞周期控制、蛋白水解、蛋 白磷酸化和RNA剪接需要的那些细胞构造在内的真核细胞构造重要的高度保守基因。此 夕卜，粟酒裂殖酵母的基因的31%被鉴定为与酿酒酵母的基因不同，而与人类同源。因 此，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母之间的遗传功能的比较正显现为研究人类基因功能的有效 方法学。术语“基因打靶(基因寻靶)，，如本文所用以在药物作用方式的筛选中转化酵母菌株，意欲指使用同源重组来改变内源基因一诸如通过破坏基因(敲除)或通过导入基 因一的遗传技术。已使牵涉特异疾病的基因从其中去除或导入其中的转基因小鼠具有 其观察到的病理学，因此允许在功能上鉴别敲除基因。由于1989年转基因小鼠的产生，基因打靶已产生了巨大的技术进步。例如，靶 基因能在特定的发育阶段被导入或导入到已经长大的成体。同时，可能设计在发育过程 中的特定时间表达的突变基因。Martin J.Evans、Oliver Smithies和Mario R.Capecchi因他 们在基因打靶方面的工作而被宣布成为2007年生理学和医学诺贝尔奖获得者。 PCR(聚合酶链反应)是用于复制和扩增DNA的分子生物学技术(美国专 利号 4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ；欧洲专利号 0200362、0201184 和 0229701 ； Methods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp.335-350, Murakawa et al.，DNA 7 ； 287-295(1988))。这个技术典型地由30至40个变性、退火和延伸的循环组成，并允许感 兴趣的基因区段选择性地扩增，甚至从DNA库中的痕量扩增。现在，已发展了基本PCR 技术的变化，包括多重PCR、巢式PCR、定量PCR、实时PCR、逆转录(RT-PCR)、递 降PCR等。实时PCR是建立的用于DNA定量的工具，因为荧光探针与引物一起使用，基于 PCR产物扩增期间按比例产生的荧光信号的检测，它测量每轮PCR扩增之后DNA产物的 积累。实时PCR能快速并方便地获得PCR结果，因为它不需要电泳测定。同时，实时 PCR具有污染风险低的优势。由于这些理由，实时PCR作为典型PCR的替代享有广泛 的使用。转化是缘于外源DNA的摄取、基因组整合和表达的细胞遗传变化。实际上， 用选择性标记来标记外源DNA以容易地选择外源DNA已被成功导入的细胞。选择性标 记的典型例子包括氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因。转化之 后，在相关抗生素存在下的培养允许成功转化的细菌的选择。在本专利技术中，通过将抗生 素抗性基因导入到相应的同源重组位点的转化来敲除裂殖酵母中的特定基因。基因合成是公知技术，自从20世纪90年代早期基于PCR的寡聚体连接的发展 后，已发表了约200篇关于基因合成的文章(Edgeet al.，Nature.292 756-62、Roufflardet al., NAR.32 176—80、Smithetal., NAR. 10 4467—82、Dillon etal.，Biotechniques.9 298-300、Ciccarelli et al.，Nucleic Acid Research.21 6007-13、Prodromou et al., ProteinEngineering. 5 827-29、Stemmer et al.，Gene. 164 49-53、Lin etal.，Gene.288 85-94、Venter et al., Proceedings National Academy of Science. 100 15440-45)。原则 上，将20bp至60bp长的寡核苷酸退火并相互连接以产生双链DNA片段，该片段然后被 用作通过PCR的期望DNA扩增的模板。可以通过基因合成获得的DNA片段通常小于 l,000bp。对于较长的基因，通过PCR连接获得的小于IOOObp的DNA片段。在2003 年，Craig Venter博士以这样的方式成功地建立φΧ174噬菌体(phiX174噬菌体)全部的 5,386-bp基因组。关于药物作用方式的筛选，最广泛使用的是体外的方法。例如，将细胞蛋 白的混合物通过具有药物附着的树脂的亲和柱，纯化因此结合到药物上的蛋白并用 MALDI-TOF 分析(Schreiber et al.，Bioorg.Med.Chem.6 1127-1152)。可选的是将人 类蛋白质噬菌体文库通过含有药物附着的树脂的亲和柱，在该文库中人类蛋白质表达在膜上，接下来选择和分析结合到药物的噬菌体以推论药物的靶蛋白(Scheetal.，Chem. Biol.6 707-716)。最近，已经对与上面的两种方本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建基因靶向的杂合裂殖酵母突变体的方法，包括将用于基因打靶的缺失盒导入到裂殖酵母菌株中，所述缺失盒包括选择性标记基因；用于微点阵的、分别定位于所述选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列；和被分别分配到定位在所述选择性标记基因的上游和下游的所述条形码碱基序列侧面的一对同源重组区，其中每个同源重组区的长度大于１５０ｂｐ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：许光来，金东旭，元美善，俞香淑，金东燮，朴翰浯，郑璟淑，张荣珠，南美英，韩尚助，崔信正，白昇泰，金炯培，许京善，李惠美，李慜镐，朴助英，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR
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