荧光化合物制造技术

一般而言，本发明专利技术涉及涉及荧光染料。本发明专利技术提供了宽范围的荧光染料和含有所述荧光染料的试剂盒，它们适用于标记各种生物分子、细胞和微生物。本发明专利技术还提供了使用荧光染料用于研究和开发、法医鉴定、环境研究，以及对病症进行诊断、预测和／或治疗的各种方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】荧光化合物本申请要求于2007年12月14日提交的美国临时专利申请61/013，956的权益， 在此将其全文引入作为参考。
技术介绍
荧光染料广泛用于生物学研究和医学诊断。荧光染料优于常规的放射性物质，因 为荧光染料通常是足够灵敏的而被检测，且花费更少、毒性更低。具体地，具有可区别的色 彩范围(color range)的不同荧光团(fluorophore)使得进行多种测定法(multiplexed assays)变得更实际可行，所述多种测定法能够平行检测多重生物学靶标。通常需要使多重 靶标平行显现的能力，用来描绘体外和体内不同生物学靶标之间的空间和时间关系。此外， 宽范围的荧光染料的产生开启了进行高通量和自动化测定的新途径，由此显著地降低了对 每测定的单元花费。此外，荧光染料的低毒性提供了体外操作的容易性，并且也使得其进行 体内生物活性成像(imaging biological activities)更安全。尽管荧光染料具有多种优点，但常规染料具有许多深切的限制。例如，常规荧光染 料通常易于发生染料间淬灭(inter-dye quenching)，这是已知为减小染料的有效亮度的 现象。常见的实践是，使给定的靶标与多种染料分子缀合，以便使得经标记的靶标(例如生 物分子如蛋白质或DNA)的亮度最大化。对于许多常规荧光染料而言，经标记的靶标的荧光 强度通常与所连接的染料分子的数目不成正比，而是比预测的强度低，这时由于例如与靶 标连接的多种染料之间发生淬灭。所述淬灭效应可部分归因于所连接的染料分子之间的物 理相互作用，这种物理相互作用可导致非荧光性染料二聚体的形成。二聚体形成可由疏水 相互作用(hydrophobic interaction)驱使。因为许多传统的荧光染料如各种若丹明染 料(rhodamine dye)和花青染料(cyanine dye)是高度疏水的芳族化合物，这些常用的染 料特别易于在经标记的生物分子上形成二聚体。已显示将磺酸根基团(sulfonate group) 加到染料中减少二聚体形成。参见，例如美国专利5，268，486和6，977，305,6, 130，101和 Panchuk-Voloshina 等人，J. Histochem. Cytochem. 47(9)，1179(1999)。然而，尽管磺化作 用可减少二聚体形成，但也将负电荷引入到了生物分子中，由此可增加破坏经标记的生物 分子的生物活性的危险。此外，仅取代有磺酸根基团的染料在受试者体内使用时可显示出 较短的血清半衰期。常规荧光染料的另一种限制因素是个体荧光基团所固有的较低荧光亮度。这种 特性通常由荧光基团的荧光量子产率(fluorescence quantum yield)决定。低的荧光量 子产率通常是由于能量从分子的电子激发态(excited electronic state)转移到振动态 和转动态(vibrational and rotational states)引起的，这是电子能量转换为热能而非 光能的过程。改善荧光基团的荧光量子产率的一种途径是使染料结构刚性化(rigidify)， 从而染料具有受限的振动和转动模式。参见例如美国专利5，981，747和5，986，093，这些 专利描述了经两个碳的链刚性化的单次甲基花青染料(monomethine cyanine dye)，所述 两个碳的链连接两个苯并噁唑鐺(benzazolium)氮原子。类似地，在美国专利6，133，445 中，三次甲基花青染料通过将桥基引入到含有三个环的稠合环系中而刚性化。刚性化的花青染料与非刚性化的对应染料相比都具有显著改善的量子产率。然而，量子产率的改善是 以损害了其它期望的特性为代价的。例如，由于这些刚性化染料的结构相对复杂，它们与常 规花青染料相比通常花费若干更多的步骤来合成，这常常伴随着较低的收率。高度刚性化 的染料也可能显示了在蛋白质上聚集的更高倾向。例如，已显示刚性化的花青染料即使当 其在蛋白质上的标记程度大大低于非刚性化花青时也形成二聚体(C00per，et al. Journal of Fluorescence 14,145(2004))。此外，已显示与常规非刚性化三次甲基花青染料相比， 刚性化的三次甲基花青染料显著降低了耐光性(photostability)(参见例如美国专利 6，133，445)。因此，对允许在各种应用中便利和有效地标记宽范围的分子的改进组合物和方法 仍然存在相当的需求。本专利技术满足了这种需求，并且提供了额外的优点。因此，本专利技术提供了可具有下列特征的任何一种或所有特征的荧光化合物。在一 方面，使用本专利技术的荧光化合物制备的经标记的生物分子显示了显著降低的二聚体形成。 在其它方面，本专利技术的化合物和经标记的生物分子显示了其它期望的特性，如更高的水溶 性，改善的荧光量子产率，改善的耐光性、相对简单的合成、对标记的缀合物(conjugate) 的改善的特异性，和/或改善的体内半衰期。本专利技术提供了式I化合物权利要求式I化合物其中F为荧光团；T为由一个或多个化学键形成且连接三个或更多不同部分的结合部分，以及其中所述结合部分含有约1 100个原子；m和n独立为0至20的整数；R1、R2和R3各自独立为(R)p (L)q ；R1、R2和R3中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1 100个原子的连接部分；R1、R2和R3中的每个p为1至20的整数；R1、R2和R3中的每个q为0至20的整数；R1、R2和R3中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或iv) H；以及其中R1、R2和R3中的至少一个R为反应性基团且R1、R2和R3中的至少另一个R为水溶性聚合物基团。FPA00001204839100011.tif2.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为占吨染料、香豆素染料、芘染料或花青染料。3.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为香豆素染料。4.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为芘染料。5.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为若丹明染料。6.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。7.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。8.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为碳水化合物。9.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为多肽。10.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约300Da。11.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约800Da。12.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量为约SOODa至约3000Da。13.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团与氨基、巯基或羟基亲核基形成共价键。14.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团为异硫氰酸酯基团、异氰酸酯基团、一 氯三嗪基团、二氯三嗪基团、卤素取代的吡啶基团、卤素取代的二嗪基团、亚磷酰胺基团、马 来酰亚胺基团、氮丙啶基团、磺酰卤基团、酰卤基团、羟基琥珀酰亚胺基酯基团、羟基磺基琥 珀酰亚胺基酯基团、四氟苯酚酯基团、亚胺酯基团、胼基团、叠氮基硝基苯基、叠氮基团、炔 本文档来自技高网...

【技术保护点】
式Ⅰ化合物：＊＊＊式Ⅰ其中Ｆ为荧光团；Ｔ为由一个或多个化学键形成且连接三个或更多不同部分的结合部分，以及其中所述结合部分含有约１－１００个原子；ｍ和ｎ独立为０至２０的整数；Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］各自独立为（Ｒ）↓［ｐ］－（Ｌ）↓［ｑ］－；Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的每个Ｌ独立为由一个或多个化学键形成且含有约１－１００个原子的连接部分；Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的每个ｐ为１至２０的整数；Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的每个ｑ为０至２０的整数；Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的每个Ｒ独立为：ｉ）当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ｉｉ）水溶性聚合物基团；ｉｉｉ）烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或ｉｖ）－Ｈ；以及其中Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的至少一个Ｒ为反应性基团且Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］和Ｒ↓［３］中的至少另一个Ｒ为水溶性聚合物基团。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛飞，梁伟义，张正英，海E胡佛，
申请(专利权)人：拜奥蒂乌姆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]