本发明专利技术涉及以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法。本发明专利技术具体提供细菌纳米磁小体连接基因疫苗的最佳磷酸盐缓冲体系的ｐＨ值范围，体外转染和体内免疫所用的磁场强度和磁场作用时间，以及用该复合基因疫苗对肿瘤模型治疗时，确定了治疗剂量范围和免疫途径。本发明专利技术从而建立一种新型简便的基因传递方式，为基因治疗提供一种新的基因疫苗的制备条件和免疫方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和肿瘤免疫领域，具体涉及一种以细菌纳米磁小体为载体的 复合肿瘤基因疫苗及其的制备方法。
技术介绍
肿瘤基因治疗是应用基因转移技术将外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正肿 瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者通过增强宿主的免疫防御功能杀伤肿瘤细胞的一种治 疗。肿瘤免疫基因治疗研究的热点是肿瘤DNA疫苗。目前对于体内基因免疫的方式主要有 直接肌肉注射免疫，电脉冲，基因枪等，几种方法各有利弊。直接肌肉注射免疫虽然简单，但 是所需的基因量大，激起的免疫反应有效。电脉冲则影响的因素众多，而基因枪虽然所需基 因量极少，但是需要的特殊的设备，造价昂贵。因此建立一种新型安全简便的基因传递方式 极为重要。细菌纳米磁小体(BMP)是新型生物学纳米材料，主要成分是狗304，直径在25nm 45nm之间，外面被脂膜包被，膜上有大量的生物活性基团，可以与药物，基因等进行共价连 接，而且连接基因后可以通过外加磁场而易于分离纯化。由于其具有趋磁性，当利用其进行 体内基因传递时，可以用外加磁场使其具有磁靶向性。国内外虽然有研究报道其可以作为 一种基因传递方式，但是对其应用的条件并未研究透彻。探索其作为基因传递方式进行体 内外应用时的一系列条件，是利用BMP为载体建立一种复合基因疫苗，为基因治疗提供一 种新的治疗模式所必要的。本专利技术就是基于以上思路。
技术实现思路
要解决的技术问题本专利技术的目的是探索。技术方案本专利技术所涉及的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗是由细菌纳米磁 小体(BMP)、聚乙烯亚胺(PEI)和肿瘤基因疫苗组成，其中细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺 肿瘤基因疫苗的连接质量比为0.3 1 1，其制备步骤包括(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；(2)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量；(3)将BMP PEI 肿瘤基因疫苗的连接质量比为0. 3 1 1，放入pH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小体-聚乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗复合 物(BMP-PEI/肿瘤基因疫苗)，该复合物就是本专利技术的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗。(4)以上的肿瘤基因疫苗为具有抗肿瘤效应的质粒DNA。本专利技术所述的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗制备方法的详细描述(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理是采用Y射线照射进行，照射剂量为 15kGy ；依照Nakamura，N.等人的方法测定细菌纳米磁小体在660nm的吸光值(Nakamura， N. , Mutsunaga. Τ. Highly sensitive detection of allergen using bacterial magneticparticles :Biosensors. Anal Chem Acta, 1993, 281, 585-589)并根据 IOD660 = 172 μ g细菌纳米磁小体对其进行定量。(2)将肿瘤基因疫苗进行紫外分光光度法测定，定量(具体方法参见《分 子克隆》第二版，科学出版社)，其中的肿瘤基因疫苗为pSLC-E7-Fc，pSLC-3P-Fc和 pCCL21-Te-Fc(Liu R, Zhou C, Wang D, et al. Enhancement of DNA vaccine potency by sandwiching antigen—codinggene between secondary lymphoid tissue chemokine(SLC) and IgG Fc fragment genes. Cancer Biol Ther.2006,5 (4) :427-34; Qin H, Zhou C, Wang D, et al. Enhancement ofantitumour immunity by a novel chemotactic antigen DNA vaccine encoding chemokinesand multiepitopes of prostate-tumour-associated antigens. Immunology.2006,117 (3) :419-30 ；Lin X, Zhou C, Wang S, et al. Enhanced antitumor effect against humantelomerase reverse transcriptase(hTERT)by vaccination with chemotactic-hTERTgene-modified tumor cell and the combination with anti-4—ΙΒΒ monoclonal antibodies. Int J Cancer. 2006,119(8) :1886-96.)；(3)将细菌纳米磁小体聚乙烯亚胺肿瘤基因疫苗的连接质量比为 0.3 1 1，放入pH值为3 8的磷酸盐缓冲体系溶液中连接，制得细菌纳米磁小体-聚 乙烯亚胺-肿瘤基因疫苗复合物，该复合物就是本专利技术的以细菌纳米磁小体为载体的复合 肿瘤基因疫苗(BMP-PEI/肿瘤基因疫苗，其中的肿瘤基因疫苗为具有抗肿瘤效应的质粒 DNA)。本专利技术对BMP、PEI和肿瘤基因疫苗连接时的缓冲体系进行调整，将NaCl溶液换成 PBS,并调整其pH值，使得BMP-PEI连接肿瘤基因疫苗的效率最高。在本专利技术中，复合肿瘤基因疫苗制备过程中，连接肿瘤基因疫苗，PEI, BMP所用的 溶液及其溶液的PH值对以上三者的连接效率有很大影响。本专利技术选用PBS作为连接缓冲 体系，比用150mM NaCl连接的效率高，用不同pH值的PBS缓冲液(pH值分别为3，4，5，6， 7,8)试验，结果发现用pH值为4 5的PBS连接效率最高，pH值超过此范围(< 4或是> 5)，连接效率均下降，进而影响复合肿瘤基因疫苗效率。在本专利技术中，复合肿瘤基因疫苗体外转染的最佳条件是需要在细胞的培养皿下 放置磁铁8 10分钟，所用的磁场强度是500mT 600mT。在本专利技术中，所选用的磁场强度是500mT 600mT，低于此范围，转染的效率会下 降。而且磁场作用的时间应为8 10分钟，高于10分钟或低于8分钟转染效率也会下降。在本专利技术中，复合肿瘤基因疫苗体内免疫的最佳条件是，当用该复合肿瘤基因疫 苗进行体内基因治疗时，皮下注射该疫苗达到微克级，并且在注射部位固定磁铁8 10分 钟，所用磁铁的磁场强度是500mT 600mT，即可达到明显的免疫效果。体内进行复合肿瘤基因疫苗免疫时，免疫方式不同，注入体内的部位不同，治疗的 效果不一样。采用皮下注射和肌肉注射复合肿瘤基因疫苗，并均在注射部位进行磁场作用，4发现采用皮下注射，外加磁场疗效最佳。皮下注射复合肿瘤基因疫苗的剂量，本专利技术摸索 40 μ g，20 μ g，10 μ g，5 μ g，发现在5 μ g复合肿瘤基因疫苗对肿瘤具有明显的治疗效果，且 与其他几组高剂量的治疗效果无差异。换言之，本专利技术涉及到以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗进行体内外 应用时，所用的磁场强度是500mT 600mT，磁场作用时间是8 10分钟，体内免疫的方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗，其特征在于该疫苗主要是由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和肿瘤基因疫苗组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张叔人，唐翌姝，王冬梅，周春霞，马文波，刘容枝，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：11
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