改性糖蛋白制造技术

提供通过化学修饰方法缀合糖蛋白的方法，并提供新的改性糖蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利说明改性糖蛋白 专利
本专利技术涉及改进药物的制备，尤其是制备具有改善的药效学和药动学性质的改性糖蛋白。
技术介绍
由于生物源蛋白通常对其天然配体具有高效力和高选择性，因此它们极有希望成为治疗药物。由于生物体已经拥有非常明确的代谢途径和清除机理可使用，生物源的本质提高了生物源蛋白无毒的可能性，从而比常规的小分子药物使用更加安全。将其与实际相结合，目前蛋白可以在许多不同的表达体系中使用重组DNA技术来制备，实现了大规模的制备，致使蛋白成为理想候选药物。然而，令人感兴趣的治疗蛋白如激素、可溶受体、细胞因子、酶等常常在体内循环半衰期较短，通常减弱了它们的治疗效用。 治疗蛋白通过许多途径从循环中被清除。对一些有药理活性的蛋白而言，存在介导其从循环中被除去的特定受体。糖基化蛋白可以被肝脏中的凝集素样受体清除，该受体仅对这些分子中的糖基部分具有特异性。已经证明蛋白和肽(特别是非糖基化的蛋白和肽)经肾脏的非特异性清除低于约50kDa。人们已经注意到无唾液酸糖蛋白比天然糖蛋白或无糖基化的蛋白在肾脏中清除更快(Bocci(1990)Advanced DrugDelivery Reviews 4149)。在治疗蛋白与自体蛋白不完全相同的情况下，它们也可以通过免疫系统从循环中被清除，即使是氨基酸序列或三维结构的细小差别可导致治疗蛋白的免疫原性。由治疗蛋白引起的免疫反应除了使其加速从循环中被清除之外，还会有其他不同的副作用接近治疗蛋白上结合位点的空间位阻使抗体可能干扰或阻碍治疗效果，人工抗体可与自体蛋白交叉反应，从而产生自身免疫反应等。人们对改性治疗蛋白感兴趣还在于使它们以特定细胞、组织或器官为目标。蛋白与对特定细胞中存在的分子具有高度亲和力的配体蛋白缀合或融合是达到该效果的已知方式之一。 因此，普遍需要提供制备改性(治疗)蛋白的方法，该蛋白具有延长的血清半衰期和/或降低的免疫原性和/或改善的药理性质。 专利技术概述 本专利技术提供可溶糖蛋白衍生物循环半衰期的延长，从而降低治疗或预防时维持循环糖蛋白治疗有效水平所需注射药物的剂量和注射频率。由于治疗或预防中可能需要的可溶蛋白的频率和数量，一些治疗活性的糖蛋白较短的血浆半衰期是不合乎要求的。本专利技术通过有效改变糖蛋白的结构和基本上维持生物活性来延长所述糖蛋白的循环半衰期。 本专利技术提供了合适的方法制备糖蛋白衍生物，在所述糖蛋白的糖基基团上引入聚合部分的肟基，所述改性糖蛋白相对于初始糖蛋白具有改善的药理性质。 因此，本专利技术涉及一种制备具有如下通式改性糖蛋白的方法 (M-L-O-N＝CH)n-P-(CH＝N-O-L’-M’)m (式I) 接头 其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头(linker)，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，该方法包括以下步骤 a)用高碘酸或高碘酸盐(periodate)离子氧化至少一个存在糖蛋白P*上的聚糖末端，其中P*代表多个糖型，以获得含有一个或多个醛基团的糖蛋白P-(CHO)n+m，和 b)将P-(CHO)n+m与M-L-O-NH2反应以得到具有(M-L-O-N＝CH))n-P-(CHO)m结构的改性糖蛋白，和 c)任选地将具有结构(M-L-O-N＝CH)n-P-(CHO)m的糖蛋白中任何没有反应的醛基团与M’-L’-O-NH2反应，以得到具有结构(M-L-O-N＝CH)n-P-(CH＝N-O-L’-M’)m的改性糖蛋白， 其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，所述高碘酸或高碘酸盐离子以小于50当量的量存在，并且其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P*具有改善的药理性质并保持其功能活性。 可以理解的是，P-(CHO)n+m中的醛基团可短暂的以它/它们的成对二醇形式或半缩醛形式存在。 还可以理解为P-和-P-是含有一个或多个氧化葡聚糖末端的糖蛋白，其中化学键与所述一个或多个葡聚糖末端相连。 本专利技术进一步涉及可通过本专利技术方法获得的改性糖蛋白。 因此，本专利技术进一步涉及具有以下通式的改性糖蛋白 (M-L-O-N＝CH)n-P-(CH＝N-O-L’-M’)m (式I) 接头其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P*具有改善的药理性质并保持其功能活性。 本专利技术还涉及包括多种具有以下通式的改性糖蛋白的制剂(preparation) (M-L-O-N＝CH)n-P-(CH＝N-O-L’-M’)m (式I) 接头其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P*具有改善的药理性质并保持其功能活性。 专利技术详述 “多种改性糖蛋白”可以理解为制剂中可能不具有完全相同的化学结构的各种改性糖蛋白，各糖蛋白分子之间可能会有相当大的不同。起始糖蛋白P*通常以不同糖型存在。“糖型”指通过转译后或翻译改性，相同蛋白与不同多糖相连接的蛋白质异形体。也有一些制剂的分子没有完全被改性，一些分子被改性一个以上的多聚体部分，然后在各个糖蛋白的不同聚糖末端再被改性。P*因此被认为是多个蛋白P糖型。 术语“非还原聚糖末端”或“未还原聚糖末端”指低聚糖的端点或末端没有被例如费林溶液或Tollens试剂还原，与低聚糖的还原端不同，它们被这些试剂氧化。在糖蛋白中，低聚糖通常由其还原端通过糖苷或葡糖胺键与蛋白相连。该低聚糖的非还原末端包括例如但不限于N-和O-聚糖类复合物上的末端唾液酸残基；杂合N-聚糖上的末端唾液酸残基；高-甘露糖N-聚糖上的末端甘露糖残基；N-和O-聚糖复合物上的末端半乳糖残基；杂合N-聚糖的末端半乳糖残基；N-和O-聚糖复合物上的末端N-乙酰半乳糖残基；杂合N-聚糖上的末端N-乙酰半乳糖残基；全部或部分外露的三甘露糖核心残基上的末端甘露糖残基；末端海藻糖残基，包括核心海藻糖残基；末端葡萄糖和木糖残基。 如果优选特定聚糖基团末端与高碘酸或高碘酸盐反应，起始糖蛋白P*可任选的被唾液酸酶、半乳糖苷酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、甘露糖苷酶或海藻糖苷酶修饰。可选择的，聚糖基团可以被例如用唾液酸转移酶、半乳糖转移酶、N-乙酰葡糖胺糖转移酶、甘露糖转移酶和各自的糖供体如CMP-Sia；UDP-Gal；GDP-Fu等改造。 使用高碘酸或高碘酸盐氧化糖蛋白的聚糖末端被充分证明，并且被用作制备蛋白缀合物的一般方法。公开号为WO06/071801的国际专利申请描述了血管假性血友病因子聚糖末端的氧化，及其用于制备蛋白PEG化型。公开号为WO00/23114的国际专利申请描述了制备干扰素-β-1a PEG化型的方法学，公开号为WO92/16555本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备具有如下通式的改性糖蛋白的方法：　（Ｍ－Ｌ－Ｏ－Ｎ＝ＣＨ）↓［ｎ］－Ｐ－（ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－Ｌ’－Ｍ’）↓［ｍ］　（式Ⅰ）　其中Ｍ和任选的Ｍ’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中Ｌ和Ｌ’独立地代表二价接头，其中Ｐ代 表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，Ｏ、Ｎ、Ｃ和Ｈ分别代表氧、氮、碳和氢原子，ｎ为１－１０，ｍ为０－５０，该方法包括以下步骤：ａ）用高碘酸或高碘酸盐离子氧化至少一个存在糖蛋白Ｐ＊上的聚糖末端，其中Ｐ＊代表多个糖型，以获得含有一个或多个醛基团的糖蛋白Ｐ－（ＣＨＯ）↓［ｎ＋ｍ］，和　ｂ）将Ｐ－（ＣＨＯ）↓［ｎ＋ｍ］与Ｍ－Ｌ－Ｏ－ＮＨ↓［２］反应以得到具有（Ｍ－Ｌ－Ｏ－Ｎ＝ＣＨ））↓［ｎ］－Ｐ－（ＣＨＯ）↓［ｍ］结构的改性糖蛋白，和　ｃ）任选地将 具有结构（Ｍ－Ｌ－Ｏ－Ｎ＝ＣＨ）↓［ｎ］－Ｐ－（ＣＨＯ）↓［ｍ］的糖蛋白中任何没有反应的醛基团与Ｍ’－Ｌ’－Ｏ－ＮＨ↓［２］反应，以得到具有结构（Ｍ－Ｌ－Ｏ－Ｎ＝ＣＨ）ｎ－Ｐ－（ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－Ｌ’－Ｍ’）ｍ的改性糖蛋白，　其中相对于糖 蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，所述高碘酸或高碘酸盐离子以小于５０当量的量存在，并且其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白Ｐ↑［＊］具有改善的药理性质并保持其功能活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C贝伦斯，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]